长链非编码RNA 在大面积烧伤后瘢痕增生患者血清中的差异性表达

徐树岑，周萍，王飞

(安徽医科大学第一附属医院烧伤科，安徽 合肥 230022)

0 引言

大面积烧伤是生活中常见的重度损伤之一，大部分大面积烧伤患者愈合后会产生严重的瘢痕增生。瘢痕是皮肤损伤后，经过各种细胞的增生爬行从而愈合后遗留的与正常组织有明显区别的组织。在创面产生后，创面四周的成纤维细胞向创口中央爬行、增殖并分泌富含胶原的细胞外基质从而填补创面的组织缺口。瘢痕愈合主要包括正常瘢痕愈合(也称为生理性瘢痕愈合)及异常瘢痕愈合(又称病理性瘢痕愈合)[1]。LncRNA 是一种长度大于200 个核苷酸的不编码的RNA，但是和编码的RNA 一样，LncRNA 对于染色体、基因簇乃至单个基因的水平发挥重要的调节作用，是基因调控网的组成部分。本研究采用新兴的LncRNA 基因芯片技术，探究在烧伤瘢痕的形成过程中LncRNA 所起到的作用，同时对比烧伤后瘢痕增生患者与正常人血清中LncRNA 表达水平的差异，以期为治疗烧伤瘢痕的未来提供了重要的基础。

1 材料和方法

1.1 一般资料

1.1.1 患者入选标准

入组标准：选取烧伤后24 小时内入院，年龄18-40 岁，致伤原因为热力烧伤，烧伤面积大于或等于30%TBSA，深度为深Ⅱ度-Ⅲ度。排除标准：电烧伤，电弧烧伤，合并有心、肺、脑、肝、肾或既往有血糖代谢异常及免疫功能异常病史等其他系统基础疾病，有免疫药物治疗史。入组病例均符合人体试验伦理学标准，并得到伦理委员会的批准，入组病例在入组前知情同意并签署知情同意书。

1.1.2 标本收集

选择2019 年在安徽医科大学第一附属医院诊断为烧伤大于体表面积30%、烧伤深度为深Ⅱ度-Ⅲ度的5 例患者为观察组，其中男性3 人、女性2 人，取样时间为创面愈合后3 月。选择5 例正常人为对照组，其中男性3 人、女性2 人，无烧烫伤史、体检结果为健康。

1.2 研究方法

1.2.1 血清制备

对照组于体检时，大面积烧伤后瘢痕增生患者在伤后治愈3 月后复查时，清晨空腹抽取静脉血液样本5mL，4℃，离心管半径10cm，静置1h，3000r离心10min，分离血清置于离心管中待测，-80℃保存。

1.2.2 芯片的选择

Arraystar LncRNA 芯片对权威数据库(如RefSeq、UCSC、RNAdb、NRED、LncRNAdb 等)和高水平文章中的LncRNA 进行了严格的筛选，并对符合筛选标准的LncRNA 进行了全面的收集。

1.2.3 探针的设计

Arraystar LncRNA 芯片针对不同转录本设计了外显子特异性探针或是剪切连接位点特异性探针，能够实现对不同转录本的准确、特异性的检测，这对LncRNA 的功能分析极为关键。此外，Arraystar LncRNA 芯片的优点在于探针与LncRNA的对应关系非常简单，采用“一个LncRNA 对应一根探针”的策略。

1.2.4 RNA 的标记、提取、杂交

于血清中加入TRIZOL(美国Invitrogen 公司)试剂，提取总RNA.应用NanoDrop ND1000 的紫外分光光度计评估所提取的RNA 量及质量，标准的变性凝胶电泳检测RNA 的完整性。采用Arraystar人类LncRNAV3.0 芯片(Arraystar 公司，美国) 检测样本中LncRNAs 的表达。根据Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis实验方案进行样品标记和基因芯片杂交：(1) 从总RNA 中移除rRNA，得到mRNA；(2) 反转录合成双链cDNA，转录成带荧光的cRNA；(3) 根据RNeasyminiKit 总RNA 试剂盒检测纯化标记的cRNAs，应用NanoDropND-1000 检测其浓度和活性；(4)芯片杂交；(5)洗涤、固定并扫描杂交芯片。

1.2.5 分析方法

通过Agilent Feature Extraction 软件获得不同组别的芯片图，并获得原始数据，进一步使用Gene Spring GX V12.1 软件对所获得的原始数据进行Quantile 标准化及数据处理.样品间具有统计学意义的差异表达LncRNA 或mRNA 通过P-value 进行FDR 筛选，参选标准：组间基因表达差异倍数2倍以上(P＜0.05，中国上海康成生物公司完成上述数据分析)。

1.2.6 统计学分析应用

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件，计量资料以均数±标准差()表示，比较用配对t检验、独立样本t检验或重复测量设计的方差分析，进一步的两两比较用Dunnett-t检验，相关性分析用Spearman 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA 的差异性表达

通过LncRNA 芯片分析出烧伤后瘢痕增生组血清中和正常对照组血清中的LncRNA 表达量，将两者的lncRNA 表达量相比较，筛选出其中变化倍数(fold change)超过2 倍并且差异有统计学意义(P＜0.05)的部分LncRNA，这部分lncRNA 被认为是差异表达的LncRNA。差异倍数达2 倍以上的LncRNA 共有2735 条；其中表达上调的有1626条；表达下调的有1109 条。因数据量太大，排序后挑选部分表达倍数更高的LncRNA 进一步研究。

2.2 变化倍数达5 倍的LncRNA

升高5 倍以上的有116 条，降低5 倍以上的有514 条(见表1)。结果表明烧伤后瘢痕增生患者和正常人的血清比较LncRNA 的表达谱差异具有统计学意义。

表1 大面积烧伤患者与正常人血清对比升高倍数＞10 倍的LncRNA(Top10)

2.3 变化倍数达10 倍的LncRNA

升高10 倍以上的有12 条，降低10 倍以上的有246 条(见表2)。

表2 大面积烧伤患者与正常人血清对比降低倍数＞10 倍的LncRNA(Top10)

2.4 分析结果及进一步研究有重点意义的LncRNA

用火山散点图(volcano plots) 的方法分析变化倍数超过2 倍，且差异有统计学意义(P＜0.05)的LncRNA，观察目标LncRNA 的分布和统计学差异。同时，在差异表达的lncRNA 中在数据库(GENCODE、RefSeq)找到了与其相关的蛋白为FGF13、SMAD1、FIGF、MMP25(见表3)。

表3 部分差异表达的LncRNA 相关的信息

3 讨论

瘢痕常常继发于皮肤组织的各种创伤与破损后，影响瘢痕形成的因素有许多，宏观上与皮肤受伤深度、患者年龄等有关，微观上与生长因子表达与调节、胶原蛋白的异常、遗传、免疫等机制有关[2]。瘢痕的形成过程主要与成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质的大量沉积有关[3]。同时在烧伤后皮肤的炎症期、恢复期、重建期中，炎症反应也是决定瘢痕形成的重要因素。产生的瘢痕无论面积大小、发生在何种位置，都会对患者产生不良的身心影响、生活质量下降，甚至正常功能的丧失[4-7]。目前国内临床上常见的治疗方法有压迫治疗、二氧化碳点阵激光、糖皮质激素、洋葱提取物、硅酮制剂、A 型肉毒素(BTA)瘢痕内注射、抗肿瘤药物注射、自体脂肪移植填充、手术切除和放射性治疗等，某些近年来新兴的治疗方法如免疫疗法等也备受关注[8-14]。近年来基因疗法正成为更新兴、有效的治疗手段。LncRNA 对细胞的分化、机体的生长发育、创伤的愈合都有重要影响[15]，且具有比编码RNA 更强的组织和细胞特异性[16]。宏观上，机体的稳定性与LncRNA 的水平密切相关；微观上，基因的相互调节与稳态也受到LncRNA 的调控[17]。

本实验结果表明烧伤后瘢痕增生患者和正常人的血清比较LncRNA 的表达谱差异具有统计学意义。在烧伤后瘢痕增生患者与正常人血清中部分LncRNA 的表达差异有统计学意义(差异倍数≥2，P＜0.05)，有些LncRNA 表达明显上调，有些LncRNA 表达明显下调。从而可以说明这些LncRNA 与烧伤后瘢痕增生存在相关关系，推断出这些差异性表达的LncRNA 在不同程度上影响了烧伤后瘢痕增生的形成过程。而在本研究中显示的与其相关的蛋白FGF13、SMAD1、FIGF、MMP25等，也在相关文献中找到其作用及影响。既往研究表明，FGF13(fibroblast growth factor) 在几种类型的癌症中过表达，如黑色素瘤和胰腺内分泌肿瘤[18-19]。FGF13 与lncRNA LINC00963下调调节结直肠癌的发生和进展有关[20]。SMAD1 基因是SMAD 家族的成员之一，SMAD 蛋白家族是细胞内重要的信号转导蛋白，直接参与转化生长因子β(transforminggrowth factor-β，TGF-β)超家族成员TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 以及骨形态发生蛋白、活化素等多个成员的信号传导；同时也参与调节多种细胞活动，包括细胞增殖、分化、迁移、凋亡，从而维持内环境的稳态。SMAD1 作为 TGF-β/ SMADs信号通路下游重要的转录因子，分布于不同组织中，并介导多种类型的生理过程[21]，SMAD1 也被报道参与LncRNA-MEG3 通过调控miR-26a/Smad1轴调控动脉粥样硬化血管平滑肌细胞增殖/凋亡平衡[22]。MMP16 是与纤维化直接相关的基质金属蛋白酶(MMP)基因家族的一部分[23]。先前的研究表明，Ⅰ，Ⅳ型胶原蛋白在伤口愈合中发挥重要作用，I 型胶原溶解是由分泌的以及在成纤维细胞介导的基质重塑过程中基质金属蛋白酶(MMP)基因家族的膜锚固定成员介导的[24]。

现如今，创面的愈合已经远远不止是治疗的终点，而如何在创面愈合后减少瘢痕的增生并保持功能的正常及外表的美观，是烧伤治疗的必经之路。根据本实验结果得出的部分LncRNA 表达出的巨大差异，通过相关蛋白质的定位及继续研究相关的通路机制，可以期待进一步研究LncRNA 对于影响瘢痕形成的作用机制将有助于在可预期的未来中更好的预防烧伤后患者瘢痕增生的发生，为瘢痕的基因治疗提供新思路。