电针通过rACC 谷氨酸能神经元缓解炎性痛伴发焦虑样行为*

2020 年国际疼痛学会将疼痛定义为“疼痛是一种与实际或潜在的组织损伤相关的不愉快的感觉和情绪情感体验，或与此相似的经历”

。流行病学调查指出，慢性疼痛在发达和发展中国家发病率分别为37%和41%

，而慢性疼痛病人出现焦虑、抑郁等负性情绪的概率高达50%

。同时焦虑等负性情绪进一步导致疼痛持续时间延长，强度变大

，形成恶性循环，最终导致慢性疼痛迁延难愈。因此治疗慢性疼痛伴发的焦虑障碍也是治疗慢性疼痛的重要方面，不容忽视。深入了解慢性疼痛与焦虑共病的神经机制，对于我们理解疼痛本质提供理论依据，同时也为治疗慢性疼痛这一全球性公共卫生难题提供新的治疗方向。

既往研究发现吻侧前扣带皮质 (rostral anterior cingulate cortex, rACC) 在慢性疼痛的维持

和痛相关情绪中均发挥重要作用

。影像学研究表明，病人慢性疼痛程度减轻与调控前扣带皮质 (anterior cingulate cortex, ACC) 激活有关

；慢性疼痛状态下出现焦虑等负性情绪时，ACC 中神经元自发性放电频率明显增加

；损毁ACC 减轻疼痛伴发的厌恶等负性情绪

。有文献证明，完全弗氏佐剂(complete Freund' s adjuvant, CFA) 能诱发大鼠的焦虑样行为

。而rACC 谷氨酸能神经元活性变化对慢性炎性痛伴发焦虑样行为是否存在作用还未见报道。目前，化学遗传学技术在疼痛相关神经机制研究中逐渐被应用

，本次实验采用高度特异性的化学遗传病毒精准操控rACC 谷氨酸能神经元，以此揭示慢性炎性痛伴发焦虑样行为的中枢机制。

临床治疗慢性疼痛常采用镇痛药联合抗焦虑抑郁药等方案

。虽然联合用药在一定程度上改善疼痛及相关负性情绪，但具有剂量依赖性，并伴有胃肠道不良反应、药物依赖等不良反应

。而电针镇痛作用明确，在治疗疼痛性疾病和情绪相关疾病均具有较好的临床效果

，且长期应用无明显不良反应。但是电针是否通过rACC 谷氨酸能神经元发挥缓解慢性疼痛伴发焦虑样行为的作用也尚未可知。

本研究通过特异性调控rACC 谷氨酸能神经元，观察其对生理状态及CFA 诱发慢性炎性痛模型大鼠的机械痛阈和焦虑样行为的影响；在此基础上，进而观察了调控rACC 谷氨酸能神经元对电针(electroacupuncture, EA) 足三里、三阴交穴位的抗炎性痛和抗焦虑样行为作用的影响，以阐述电针干预疼痛伴发焦虑样行为的中枢机制。本实验结果以期能为临床研发治疗慢性炎性痛高效特异药物提供新的方案和基础研究依据。

方 法

1. 实验动物与分组

实验动物选用清洁级健康雄性SD 大鼠67 只，体重(300±20) g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置遵照中华人民共和国科学技术部2006 年颁布的《关于善待实验动物的指导意见》，并通过浙江中医药大学动物实验研究中心医学伦理委员会审核(10745)。

行为学结束后90 min 进行动物取材。3%戊巴比妥钠按照60 mg/kg 剂量麻醉大鼠，充分暴露心脏，灌注针头由心尖插入，经左心室，到达升主动脉，止血钳固定灌注针头，剪开右心耳，快速灌注PBS 溶液200 ml（北京索莱宝科技有限公司），直至大鼠四肢和肝脏变白，随后缓慢推注4%多聚甲醛溶液200 ml（上海展云化工有限公司）。灌注结束后取出全脑，置于多聚甲醛溶液中24 h，并使用15%和30%的蔗糖（无锡市展望化工试剂有限公司）梯度脱水，至大脑完全沉底后经液氮快速冷冻，于-80℃冰箱保存。

2. 造模和处理方法

很多驾驶员尤其是女司机都不知道驾驶证有效期这事。2016年4月1日施行新《机动车驾驶证申领和使用规定》，驾驶证有效期为6年、10年、长期，这对驾驶员来说是提供了很大的便利，在一定程度上降低了人们对驾驶证有效期的关注度。驾驶证有效期在驾驶证上有详细说明，驾驶证过期后上道开车不但会受到交警的处罚，发生交通事故只有交强险赔付，商业险拒赔。

电话很快就通了，“喂，徐艺，跟你打听个事儿，早几天同学聚会，你好像说过胜利大厦的事……你告诉我，这里面是不是有什么猫腻？徐艺我可跟你说，有什么事你可不能瞒着我，噢，是这样，我们刚接了个电话，是从胜利大厦打来的，说让我们开台转播车过去……你知道是怎么回事吗？”

（3）电针处理：电针组大鼠在造模后28 天进行一次电针干预。针刺穴位为双侧后肢“三阴交”穴和“足三里”穴（穴位定位方法参照《实验动物穴位图谱》）。电针（韩氏HANS 200E 型电针仪，北京华卫产业开发公司）参数如下：频率：100 Hz，强度：初始强度0.5 mA，每隔20 分钟增加0.5 mA，时间：60 分钟。

（4）调控rACC 脑区谷氨酸能神经元活性：通过定位后，在大鼠rACC 处微量注射化学遗传病毒(AAV2/9-CaMKIIα-hM3Dq-mCherry)，造模后28 天（旷场实验前30 分钟）腹腔注射氯氮平一氧化氮(clozapine N-oxide, CNO，浓度：2 mg/kg）以激活rACC 谷氨酸能神经元；通过定位后，在大鼠rACC处微量注射化学遗传病毒 (AAV2/9-CaMKIIα-hM-4Di-mCherry)，造模后28 天（旷场实验前30 分钟）腹腔注射CNO 以抑制rACC 谷氨酸能神经元。对照组大鼠腹腔注射等量0.9%无菌生理盐水。

（1）脑内病毒注射：造模前14 天，进行脑内病毒注射。首先用3%戊巴比妥钠按照60 mg/kg 剂量腹腔注射麻醉大鼠；后将大鼠固定在脑立体定位仪（RWD 公司）上并进行调平，充分暴露骨缝（包括人字缝和十字缝）。测量bregma 的x、y 坐标位置，根据Paxinos and Watson 的大鼠大脑图谱（第六版）确定rACC（图谱方位参数：+ 3.00 mm anterior to bregma, ±0.8 mm mediolateral, -1.4 mm dorsoventral）的位置。脑图谱中大鼠AP = 9 mm，将实际测量的AP 值与图谱等比例换算，得出该大鼠实际rACC 坐标。位置确定后，将AAV2/9-CaMKIIα-hM3Dq/hM4Di-mCherry（武汉枢密脑科学技术有限公司）注射至rACC 内，剂量为每只 400 nl，病毒滴度为 5.34E + 12 vg/ml。大鼠苏醒后放回饲养笼中，后续进行行为学检测。

3. 行为学检测

如图1所示，为了尽可能提高M2e的蛋白量，采用3个M2e序列串联形成3M2e；同时为了提高小多肽段（M2e）的抗原性，在3M2e前加接一个鞭毛蛋白基因（FljB基因），合成出Flagellin-3M2e的DNA片段。 目的基因Flagellin-3M2e被构建于表达载体pET28a相应位置（EcoRⅠ-XhoⅠ），经内切酶鉴定（图1）和基因测序确定序列正确。

（2）焦虑样行为检测：造模后28 天进行旷场测试 (open field test, OFT)，检测时间为8:00 am～12:00 am。室内环境保持湿度为45%～55%、温度为23～25℃，噪音为40 分贝以下，室内用低亮度壁灯进行照明。测试前将大鼠放置于房间1小时适应环境。

首先在大鼠rACC 处微量注射化学遗传病毒(AAV2/9-CaMKIIα-hM3Dq-mCherry)（见图1A, B）。42 天后通过免疫荧光染色，在rACC 观察到增强的红色荧光 (mCherry) 信号（见图1C）。经统计显示，病毒与谷氨酸能神经元标记物 (CaMKIIα) 共表达率为80%（见图1D, E）。并且与对照组（C + hM-3Dq + Saline 组）相比，rACC 谷氨酸能神经元激活组（C + hM3Dq + CNO 组）中mCherry 和c-Fos 的共表达明显增加（

＜ 0.05，见图1F, G）。由此表明化学遗传方法能够发挥特异性激活rACC 谷氨酸能神经元的作用。OFT 结果显示，与对照组相比，激活组大鼠在旷场的中央运动时间明显降低(

＜ 0.05)，且这两组的运动总距离无明显差异（见图1 H-J）。在机械性痛阈检测中，与对照组相比，激活组痛阈并无显著性差异（见图1K）。以上结果提示，特异性激活rACC 谷氨酸能神经元能够诱发生理状态大鼠的焦虑样行为。

4. 取材及后固定

为使大鼠适应实验环境，正式开始实验前进行适应性喂养1 周（室温23～25℃，湿度40%～60%）。大鼠自由获取水和食物，饲养环境有良好的通风和空气过滤系统，12 小时明暗循环。采用区组随机法将大鼠分为6 组：空白对照组（C + hM3Dq + Saline组，

= 11）、空白 + rACC 激活组（C + hM3Dq +CNO 组，

= 11）、模型对照组（M + hM4Di + Saline组，

= 11）、模型 + rACC 抑制组（M + hM4Di + CNO组，

= 14）、模型+电针组（M + hM3Dq + Saline +EA 组，

= 10）、模型+ rACC 激活+电针组（M +hM3Dq + CNO + EA 组，

= 10）。

5. 免疫荧光染色

对取材后的脑组织使用冰冻切片机（美国Thermo Fisher Scientific 公司）进行切片，厚度为30 μm。组织切片先用10%驴血清 (Solarbio) 封闭液在37℃恒温水浴箱封闭1 h。随后加入一抗于4℃冰箱孵育18 h：Anti-c-Fos (Rabbit, 1:500, ab190289, Abcam)，或Anti-CaMKII（Mouse, 1:500, ab22609, Abcam)，TBST 清洗后加入二抗：Donkey anti-rabbit 488 (1:800, Jackson ImmunoResearch)，或Donkey anti-mouse488 (1:800, Jackson Immuno Research) ，37℃恒温水浴箱孵育1 h。最后使用抗荧光淬灭剂（含DAPI, ab104140, Abcam）封片，该实验全过程避光。采用VS-120数字病理切片（荧光）扫描仪（Olympus 公司）观察荧光信号，并用Sense Dimension 系统采集图片及后期处理工作。

其中两款搭配四圈皮革表带，靛蓝托帕石色皮革表带或紫藤玉色皮革表带均搭配金属装饰。充斥现代感的色调折射出以意大利珠宝巨匠为代表的时尚设计师紧随时代潮流的步伐。

（2）造模：采用足底皮下注射CFA 乳化液的方法复制慢性炎性痛模型

，模型组各组大鼠于左足底注射0.1 ml CFA（sigma 公司）乳化液，对照组大鼠左后足底注射0.1 ml 0.9%无菌生理盐水（杭州民生药业有限公司）。

6. 统计学分析

2.4.1 HPLC-MS指纹图谱的生成 取69批药材样品粉末各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》对69批药材样品的HPLC图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。

结 果

1. 特异性激活rACC 谷氨酸能神经元诱发生理状态大鼠的焦虑样行为

旷场是1 m×1 m×1 m 的正方形黑色无盖木质箱体，将旷场底部平均分成16 个正方形方格区域，中间4个方格为中央区域，周围12个方格为外围区域。测试时，将大鼠放置在旷场中央，适应30 s 后，使用ANY-maze 动物行为视频跟踪系统（美国Stoelting 公司）记录大鼠在旷场5 min 的自发活动情况。每只大鼠结束后清洁旷场并使用10%酒精擦拭旷场底部和侧面，防止残留痕迹和气味对后续大鼠行为造成影响。

（1）机械性痛阈检测：采用动态足底触觉仪（意大利UGO Basile 公司）进行机械缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT) 检测，检测时间点为造模后第27 和28 天。首先将大鼠置于底面为铁丝网的透明有机玻璃盒中，盖上透气盖子，适应20 分钟，待安静后进行痛阈检测。将测痛仪上的不锈钢针（直径0.5 mm）移动至大鼠左后足掌中央，操作测痛仪以0～50 g/20 s 的线性压力进行压力试验，大鼠抬脚时的值为缩足阈值。连续进行5 次测量，每次间隔30 s，取后4 次测量的平均值作为大鼠机械痛阈值。测痛时保持周围环境安静，室内温度为23～25℃，每次测痛时间为9:00 am～12:00 am，每次测痛前先进行测痛仪的校准。

2. 特异性抑制CFA 模型大鼠rACC 谷氨酸能神经元缓解其焦虑样行为

基于以上研究，我们探讨rACC 谷氨酸能神经元活性变化对CFA 模型诱发焦虑样行为和机械性痛阈的影响。造模前14 天，在大鼠rACC 处微量注射化学遗传病毒 (AAV2/9-CaMKIIα-hM4Di-mCherry)（见图2A）。42 天后通过免疫荧光染色，在rACC脑区观察到增强的红色荧光 (mCherry) 信号（见图2B）。统计显示，与对照组（M + hM4Di + Saline 组）相比，rACC 谷氨酸能神经元抑制组（M + hM4Di +CNO 组）中mCherry 和c-Fos 的共表达明显减少（

＜ 0.05，见图2C, D），由此说明化学遗传方法能够发挥特异性抑制rACC谷氨酸能神经元的作用。OFT 结果显示，与对照组相比，抑制组在旷场试验中表现出更多的中央运动时间(

＜ 0.05)，且两组的运动总距离无明显差异（见图2E-G）。在机械性痛阈检测中，两组痛阈值无明显变化（见图2H）。以上结果提示，特异性抑制rACC 谷氨酸能神经元能够缓解CFA 模型大鼠的焦虑样行为。

文章的标题“柏拉图的真之学说”很容易让人觉得海德格尔要对柏拉图那里的“真”做一番系统的研究。但是海德格尔一开始就区分了“科学的知识”和“思想家的学说”：

3. 特异性激活rACC 谷氨酸能神经元阻断电针对CFA 大鼠焦虑样行为的治疗作用

上述结果证明抑制rACC 谷氨酸能神经元能缓解慢性炎性痛模型大鼠焦虑样行为。既往研究表明，电针能够有效缓解焦虑症状

。由此我们猜想电针可能是通过降低rACC 谷氨酸能神经元活性发挥缓解焦虑样行为的作用。为了验证这一猜想，本实验在电针干预的同时将rACC 谷氨酸能神经元激活，观察电针抗焦虑样行为的作用是否还存在。在造模前14 天，首先于大鼠rACC 处微量注射化学遗传病毒 (AAV2/9-CaMKIIα-hM3Dq-mCherry)（见图 3A,B）。并在造模后28 天，于大鼠双侧后肢“足三里”“三阴交”进行电针干预（见图3C）。OFT 结果显示，与对照+电针组（M + hM3Dq + Saline + EA组）相比，激活+电针组（M + hM3Dq + CNO + EA 组）中央运动时间明显减少(

＜ 0.05)，且两组大鼠运动总距离无明显差异（见图3D-F）。在机械性痛阈检测中，对照 + 电针组与激活 + 电针组在电针治疗前后其痛阈均明显上升（

＜ 0.05，见图3G）。以上结果提示，电针通过抑制rACC 谷氨酸能神经元活性发挥缓解慢性炎性痛模型大鼠焦虑样行为的作用。

讨 论

疼痛是一种多维度的主观体验，当疼痛持续存在、变为慢性疼痛时，将严重影响病人的生活质量

，导致病人出现焦虑、抑郁等负性情绪

，这种负性情绪被定义为痛情绪。痛情绪会进一步增加病人的疼痛感，从而形成疼痛-负性情绪-深度疼痛的恶性循环。与其他情感不同，痛情绪是基于个体接收伤害性刺激，并将这种疼痛信息传递至中枢、而后在相应脑区进行信息整合而形成的一种情感体验

。研究表明，当疼痛长期发生成为慢性疼痛时，其大脑皮质就会发生突触可塑性变化，这些变化在慢性疼痛的疼痛感知和相关情绪障碍（如焦虑、抑郁等）等密切相关

。临床上慢性疼痛包括神经病理性痛、慢性炎性痛、术后痛等，本研究此次以慢性炎性痛为主来探讨其对情绪的发生机制。红、肿、热、痛是临床上炎症的主要表现，而持续不愈的炎症会形成慢性炎性痛，对病人造成巨大的身心伤害。本实验采用CFA 乳化液进行左足底注射以建立慢性炎性痛模型，来模拟临床常见的慢性炎性痛病例。并且从慢性疼痛模型伴发焦虑情绪的中枢机制来探讨痛情绪的发生发展，从而为慢性疼痛的治疗提供更为全面的方案。

ACC 是疼痛感知、慢性疼痛及痛相关负性情绪的重要皮质区域

，分为rACC 和尾侧前扣带皮质(caudal anterior cingulate cortex, cACC)，其中rACC对疼痛伴发的厌恶情绪起着调节作用，但对疼痛本身没有影响

。ACC 中分布大量的锥体神经元（以谷氨酸能神经元为主）和抑制性中间神经元（以γ-氨基丁酸能神经元为主）。并且在ACC 中抑制性神经元接受兴奋性谷氨酸能神经元支配，两者间兴奋/抑制(excitatory/inhibitory, E/I) 协调平衡以维持rACC功能状态

。有文献表明，ACC 谷氨酸能突触传递增强促进痛相关焦虑样行为产生

。同时电生理结果证明，在神经病理性痛模型大鼠诱发焦虑样行为时，ACC 中锥体神经元（以谷氨酸能神经元为主）兴奋性突触后电流频率和振幅明显增加，而通过光遗传抑制ACC 谷氨酸能神经元能够缓解痛相关焦虑样行为

。但rACC 谷氨酸能神经元活性变化对慢性炎性痛模型伴发焦虑样行为的影响却少有研究。本实验采用化学遗传方法，特异性调控rACC谷氨酸能神经元，并通过行为学检测其活性变化对于CFA 模型大鼠疼痛和焦虑样行为改变情况。结果提示，激活rACC 谷氨酸能神经元，能诱发生理状态大鼠的焦虑样行为；而抑制rACC 谷氨酸能神经元，能缓解CFA 模型大鼠的焦虑样行为。因此，通过调控rACC 谷氨酸能神经元活性可能是治疗慢性疼痛伴发焦虑样行为的有效方法之一。

电针在临床上已被广泛应用于疼痛和情绪相关疾病的治疗，且疗效较好。在众多基础研究中也证实了电针在治疗痛症和情绪疾病的作用。CFA 模型大鼠的红肿痛主要表现在左足底局部，因此本实验以局部选穴为主。在中医理论中，焦虑症等情绪病多由脏腑功能失调、气机失常所致，常涉及脾、心、肝、肾等多个脏腑。而“足三里”属于足阳明胃经合穴、胃之下合穴，能够发挥调理脾胃气血、补中益气、通调脏腑气机的作用。“三阴交”属于足太阴脾经穴位，为足三阴经交会穴，可以调理肝脾肾三脏，能疏肝解郁、补虚培元。故而“足三里”和“三阴交”也是临床上电针治疗情绪疾病的常用穴。Du 等

的研究表明，电针特定穴位能缓解慢性炎性痛大鼠的疼痛及相关焦虑情绪。本课题组前期实验证明，100 Hz 电针刺激足三里、三阴交能缓解痛相关负性情绪

。所以我们选择在病理状态下激活rACC 谷氨酸能神经元活性并进行电针干预，且采用100 Hz 电针刺激足三里、三阴交，来探讨电针的治疗效果。本研究在行为学前进行一次电针干预，发现激活rACC 谷氨酸能神经元后会增强焦虑样行为，但并不影响电针镇痛效果。由此说明，激活rACC 谷氨酸能神经元能反转电针对CFA 模型大鼠焦虑样行为的缓解作用。本研究提示，电针对慢性炎性痛伴发焦虑样行为的治疗作用是通过抑制rACC 谷氨酸能神经元活性实现的。

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本研究通过探讨rACC 谷氨酸能神经元活性变化对慢性炎性痛模型大鼠焦虑样行为的影响，进一步发现电针能够通过抑制rACC 谷氨酸能神经元活性来缓解慢性炎性痛大鼠的焦虑样行为，研究成果为阐明电针镇痛科学内涵提供了理论依据，对慢性疼痛的治疗方案优化具有一定的指导价值。rACC脑区内部存在多种神经元类别，本次实验仅研究了慢性炎性痛伴发焦虑样行为状态下rACC 脑区中谷氨酸能神经元活性改变，而在该状态下rACC 脑区内部其他神经元发生了何种改变以及与谷氨酸能神经元之间的联系在本实验中暂未进行，仍需后期进行深入研究。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。

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