应用MALDI-TOF MS 分析黄连素作用前后耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌质谱峰图的改变

许敏静 林少华 干铁儿

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是社区获得感染、医院内获得感染的重要病原菌之一，且耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的感染呈逐年上升[1]，给临床诊治带来了极大挑战。研究发现，黄连素能较好地抑制CRKP 的生长，并且有逆转CRKP 耐药性的作用[2]。基于此，本研究拟采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（matrix-assisted laser desorption ionization time -of -flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）对黄连素作用前后CRKP 进行分析，评估黄连素作用后细菌蛋白质峰谱的改变。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集浙江中医药大学附属第一医院门诊及住院患者的产CRKP 菌20 株（去除来自同一患者的重复菌株），所有菌株均经质谱鉴定和耐药基因确认。

1.2 试剂和仪器 哥伦比亚血琼脂培养基（温州康泰生物技术有限公司），营养肉汤培养基（杭州滨和微生物试剂有限公司,批号200217），黄连素（浙江省杭州市华东大药房，批号16110312），0.45% NaCL样本稀释液（法国生物梅里埃公司，批号C0550），三氟乙酸（批号202010022）、乙腈（批号202010081）、甲酸（批号202010031）（成都艾科达化学试剂有限公司），α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA，批号0000370825）（布鲁克·道尔顿公司），Densichek Plus比浊仪（法国生物梅里埃公司），96 孔加样板，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪（德国Bruker 公司）。

1.3 质量控制 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪自动分类程序由BTS（布鲁克·道尔顿公司）作为校准品进行自动验证，质控菌株大肠埃希菌ATCC25922（购自国家卫生健康委临检中心）。

1.4 方 法

1.4.1 营养肉汤 取22g 营养肉汤培养基加1000 mL蒸馏水，加热溶解，121 ℃高压灭菌，4 ℃冰箱保存备用（不超过2 周）。

1.4.2 黄连素原液 将黄连素溶解于无菌生理盐水中，加热溶解，用营养肉汤稀释成终浓度为256 μg/mL的溶液，置4 ℃冰箱保存备用（不超过1 周）。

1.4.3 菌悬液制备 取哥伦比亚血琼脂培养基培养过夜的产CRKP 菌新鲜菌落于NaCl 浓度为0.45%样本稀释液中，配制成相当于0.5 麦氏单位的菌悬液（1.5×108cfu/mL 菌悬液），再用0.45%生理盐水稀释100 倍至1.5×106cfu/mL 备用。

1.4.4 菌株培养 取1 μL 菌悬液接种于含黄连素的营养肉汤中，并以空白营养肉汤作对照组，于35 ℃振荡培养5 d，孵育结束后用接种环转种至哥伦比亚血平板，35 ℃孵育18～24 h，得到第2 代菌株；同样方法对2 代菌株进行培养得到第3 代菌株。

1.4.5 菌株鉴定 将上述菌株用MALDI-TOF MS进行鉴定，具体操作方法参照文献[3]。将所得的质谱峰图与MALDI Biotype 3.0 软件（德国Bruker 公司）中的数据库进行比较，并用匹配分值来给结果定级。分值为2.300～3.000 可以准确的鉴定到种水平；分值为2.000～2.299 可以准确的鉴定到属。

1.5 统计学方法 应用ClinProTools 3.0 软件对各菌株质谱峰图谱进行分组分析。具体步骤参照仪器自带的ClinProTools 3.0 软件介绍与操作指南。基本参数维持不变，将所有菌株分成三组（原始菌株、2 代菌株和3 代菌株），然后分别将原始菌株和2 代菌株、原始菌株和3 代菌株进行分析，分别选择遗传算法（GA）、快速分类算法（QC）、监督式神经网络算法（SNN）对数据进行分析并建立相应的模型。每一模型中的识别能力（recognition capability）和交叉验证（cross validation）分别体现了该模型的灵敏性和特异性。

2 结果

2.1 鉴定结果 20 株试验菌株经MALDI-TOF MS鉴定结果全部为肺炎克雷伯菌，其分值均＞2.300，可以准确鉴定到种水平。

2.2 ClinProTools 软件分析结果

2.2.1 算法统计 进行峰统计之后，ClinProTools 将原始菌株组和3 代菌株组细菌较清晰地划分成两个区域，大部分菌株准确落在相应的分组中，只有1 个3 代菌株落在原始菌株组种（见图1）。通过GA、QC和SNN 三种方法得出的结果基本相似，其灵敏度均大于95.00%，其中SNN 算法得出的灵敏度最高（100.00%），其次GA、QC 算法的灵敏度均为97.50%；GA、SNN 和QC算法的特异性分别为89.90%、92.36%、88.86%（见表1）。

图1 原始菌株与3 代菌株的二维分析图

表1 应用ClinProTools 3.0 软件得到的各个算法模型的灵敏度与特异性

2.2.2 特征性峰数据统计 采用ClinProTools 对质谱峰统计结果显示，峰169、158、174、168 为区分的最为主要的特征峰，这4 个特征性峰的Anderson-Darling 检验的P 值（PAD）均接近0（见表2），因这些峰呈非正态性分布，而秩和检验的P 值（PWKW）值均＜0.05，说明两组菌株之间的这4 个峰的差异有统计学意义。

表2 区分原始菌株和三代菌株的特征性峰的峰值统计数据

3 讨论

近年来，MALDI-TOF MS 为一种快速鉴定病原性细菌种属的新技术，是利用微生物之间拥有的自身独特的蛋白质组成原理，分析检测蛋白质指纹图谱,经过软件分析处理，再与数据库比对，通过分析病原菌菌株间蛋白丰度的细小差异[4]，能在几分钟之内完成对微生物种或属水平的鉴定。在临床中，MALDI-TOF MS 技术的应用不仅限于菌种或属的快速鉴定[5-6]，同时已涉及多个领域，如流行病学、细菌快速分型、耐药分析和毒力检测等[7]，尤其是目前耐药菌感染的严峻形势，学者们加快了对快速检测细菌耐药性及其变迁方法的探索,应用MALDI-TOF MS寻找特异质谱峰是分析耐药性及其变迁的关键。

Gaibani 等[8-9]评估了实时单峰法检测CRKP 的性能，结果显示，准确率为98%、阳性预测值为98%、阴性预测值为97%。该方法的高预测值表明MALDI-TOF MS 可作为筛选CRKP 的一线工具。本研究应用MALDI-TOF MS 比较阴性对照（原始菌株）和待测菌株（黄连素感触后）所记录的峰值数量和强度，当细菌耐药性变化越大时,峰谱图发生变化越大，对20 株CRKP 菌株图谱建立模型，得到二维图显示作用前菌株和第3 代菌株大部分落在相应的分组中，说明菌株的蛋白质结构发生变化，且两者间存在较大的差异。三种算法灵敏度均大于95%，特异性大于88%；峰169、158、174、168 是用于区分的最为主要的特征性峰，可能原因是黄连素改变了CRKP 蛋白或者多肽的表达，导致形成的峰谱图出现差异。但也存在少量 菌株模棱两可的情况，无法清晰地分入组中，可能存在一些可影响因素，比如细菌培养基的选择、细菌的培养条件、样品处理以及基质结晶等可能会影响质谱的峰图[10]，因此实验还需要进一步完善。

综上所述，使用MALDI-TOF MS 技术对黄连素作用前后的产CRKP 菌进行蛋白质峰谱分析，结果显示黄连素作用后其蛋白质谱峰有显著差异，可能黄连素改变了CRKP 菌某些基因序列，从而改变了蛋白质或多肽的表达，改变的结构与其耐药性可能存在相关性，但对使用黄连素后改变的蛋白所对应基因尚未有明确，有待于进一步研究，这也为后续的进一步研究提供思路。同时应用MALDI-TOF MS 分析质谱图的峰值变化可提示某些耐药类型，对于已有MALDI-TOF MS 设备作为常规细菌种或属鉴定的临床实验室，对细菌耐药性相关质谱峰分析只需增加数据分析步骤，成本低廉，也避免工作人员复杂的操作培训，具有远大的应用前景。