槲皮素联合贯叶金丝桃提取物对脂多糖诱导小鼠抑郁样行为的影响及作用机制研究

鲍斐斐 华 深 陈勇华

文献报道，全球约有3.5 亿抑郁症患者，且预计到2030 年，抑郁症患者在全球范围内已成为人类死亡的第二大疾患，且逐年呈递增趋势[1]。该病以悲观失望、睡眠困难、自卑、记忆减退等为主要临床症状，具有易发病、易致残、易反复等特点。目前，临床常采用西药治疗抑郁症，但西药具有不良反应，且停药后，易复发。槲皮素是一种天然的黄酮类物质，具有抗血栓、神经保护、调节免疫等药理作用[2]。贯叶金丝桃含有金丝桃苷、伪金丝桃素、金丝桃素等，具有抗炎镇痛、抗抑郁、抗抑郁、调节免疫等药理作用[3]。本研究探讨槲皮素联合贯叶金丝桃提取物对脂多糖诱导小鼠抑郁样行为的影响及相关机制。

1 实验材料

1.1 动 物 7 周龄雄性清洁级C57BL/6 小鼠90只，购自重庆医科大学实验动物中心，体质量（200±20）g，动物生产许可证号：SCXK（渝）2018-0003，动物使用许可证号：SCXK（渝）2018-0021，动物质量合格证号：2020134617，饲养于重庆医科大学实验动物中心，设置温度为23～25 ℃，湿度为50%～60%，自由进食及饮水。适应性饲养1 周后，在浙江省立同德医院动物实验室进行实验，由鲍斐斐、华深、李晓一、陈勇华等共同参与实验，在实验过程中需严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要药物 脂多糖（美国sigma 公司，批号L2880）；盐酸氟西汀分散片（礼来苏州制药有限公司，批号7339A，分包装批号7339AA）；贯叶金丝桃提取物（由我院实验室自制，每克含贯叶金丝桃素不低于1.61 mg，给药制剂含贯叶金丝桃提取物不低于55%，批号0180518）。

1.3 仪器及试剂 自主活动实验视频分析系统（淮北正华生物仪器设备有限公司，型号ZHZFT）；自动酶标仪（华卫德朗仪器有限公司，型号DR-200Bs）；低温离心机（德国Eppendorf AG 公司，型号5427R）；超声细胞粉碎机（新芝生物科技股份有限公司，型号scientz-IID）；槲皮素（美国sigma 公司，批号337951）；白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）酶联免疫吸附试剂盒（北京方程生物科技有限公司，试剂批号MM-0670R22）；去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（NA）试剂盒（北京诚林生物技术有限公司，批号20170201、20170106）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药 90 只雄性C57BL/6 小鼠采用随机数字表法分为对照组、模型组、盐酸氟西汀组、槲皮素组、贯叶金丝桃提取物组和槲皮素联合贯叶金丝桃提取物组，各15 只。除对照组外，其余各组小鼠均单次注射1 mg/kg 脂多糖，制备抑郁模型[4]。采用旷场实验（OFT）[5]观察是否制备成功。OFT：小鼠注射药物12 h 后，放入测试箱正中格内，适应3 min，采用Anaze Y 软件记录小鼠5 min 内穿格次数和运动路程。

槲皮素组给予50 mg/kg 槲皮素灌胃，贯叶金丝桃提取物组给予50 mg/kg 贯叶金丝桃提取物灌胃，槲皮素联合贯叶金丝桃提取物组给予槲皮素联合贯叶金丝桃提取物各50 mg/kg 灌胃，盐酸氟西汀组给予2.6 mg/kg 盐酸氟西汀灌胃，对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每天1 次，连续给予21 d。给药剂量参考文献[6]。

2.2 糖水偏好实验 对小鼠进行禁食禁水20 h。在每个鼠笼里面放置清水和蔗糖水各100 mL，1 h 后取出，再次称重，记录剩余重量。糖水偏好值=糖水消耗量/（糖水消化量+清水消化量）×100%。

2.3 水迷宫实验 采用圆形水池（直径120 cm），将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ个象限，将平台放入水中，使平台低于水面1 cm，目标象限为第Ⅲ象限（平台所在象限），水温设置为21 ℃左右，用墨汁将水染成黑色。上述糖水偏好实验后，将小鼠根据Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ个象限的顺序面朝池壁放入水中，对小鼠找到平台所需时间（潜伏期）和所占目标象限百分比进行记录。

2.4 小鼠脑组织炎症细胞因子及单胺类神经递质水平 上述实验结束后，将小鼠断颈取脑，将小脑去除后称重脑组织，根据脑组织重量与预冷酸性正丁醇溶液按照1∶10 的比例放入电动玻璃匀浆机匀浆。混匀后离心取上浆液，IL-6、IL-10 水平采用酶联免疫吸附法检测，NE、NA 采用荧光分光光度计按荧光光度测定法测定。

2.5 统计学方法 应用SPSS 21.0 软件分析数据。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验；计数资料以率（%）表示，采用卡方χ2检验。以P＜0.05 认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组小鼠糖水偏好比较 对照组及槲皮素联合贯叶金丝桃提取物组小鼠糖水摄入量明显高于模型组、盐酸氟西汀组、槲皮素组、贯叶金丝桃提取物组（P 均＜0.05）；槲皮素组、盐酸氟西汀组、贯叶金丝桃提取物组、槲皮素联合贯叶金丝桃提取物组糖水摄入量均高于模型组（P 均＜0.05）；贯叶金丝桃提取物组糖水摄入量明显高于槲皮素组、盐酸氟西汀组（P＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠糖水偏好比较（）

表1 各组小鼠糖水偏好比较（）

注：对照组及模型组给予50 mg/kg 生理盐水灌胃；盐酸氟西汀组给予2.6 mg/kg 盐酸氟西汀灌胃；槲皮素组给予50 mg/kg 槲皮素灌胃；贯叶金丝桃提取物组给予50 mg/kg 贯叶金丝桃提取物灌胃；槲皮素联合贯叶金丝桃提取物组给予槲皮素联合贯叶金丝桃提取物各50 mg/kg灌胃；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与盐酸氟西汀组和槲皮素组比较，cP＜0.05；与贯叶金丝桃提取物组比较，dP＜0.05

3.2 各组小鼠水迷宫实验结果比较 对照组及槲皮素联合贯叶金丝桃提取物组潜伏期明显低于模型组、盐酸氟西汀组、槲皮素组、贯叶金丝桃提取物组（P均＜0.05），所占目标象限时间百分比明显高于模型组、槲皮素组、盐酸氟西汀组、贯叶金丝桃提取物组（P 均＜0.05）；槲皮素组、盐酸氟西汀组、贯叶金丝桃提取物组潜伏期明显低于模型组（P 均＜0.05），所占目标象限时间百分比明显高于模型组（P 均＜0.05）；贯叶金丝桃提取物组潜伏期明显低于槲皮素组、盐酸氟西汀组（P 均＜0.05），所占目标象限时间百分比明显高于槲皮素组、盐酸氟西汀组（P 均＜0.05），见表2。

表2 各组小鼠水迷宫实验结果比较（）

表2 各组小鼠水迷宫实验结果比较（）

注：对照组及模型组给予50 mg/kg 生理盐水灌胃；盐酸氟西汀组给予2.6 mg/kg 盐酸氟西汀灌胃；槲皮素组给予50 mg/kg 槲皮素灌胃；贯叶金丝桃提取物组给予50 mg/kg 贯叶金丝桃提取物灌胃；槲皮素联合贯叶金丝桃提取物组给予槲皮素联合贯叶金丝桃提取物各50 mg/kg 灌胃；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与盐酸氟西汀组和槲皮素组比较，cP＜0.05；与贯叶金丝桃提取物组比较，dP＜0.05

3.3 各组小鼠脑组织炎症细胞因子水平比较 对照组与槲皮素联合贯叶金丝桃提取物组脑组织IL-6水平明显低于模型组、盐酸氟西汀组、槲皮素组、贯叶金丝桃提取物组（P 均＜0.05），IL-10 水平明显高于模型组、槲皮素组、盐酸氟西汀组、贯叶金丝桃提取物组（P 均＜0.05）；槲皮素组、盐酸氟西汀组、贯叶金丝桃提取物组IL-6 水平明显低于模型组（P 均＜0.05），IL-10 水平明显高于模型组（P 均＜0.05）；贯叶金丝桃提取物组IL-6 水平明显低于槲皮素组、盐酸氟西汀组（P 均＜0.05），IL-10 水平明显高于槲皮素组、盐酸氟西汀组（P 均＜0.05），见表3。

表3 各组小鼠脑组织炎症细胞因子水平比较（pg/g，）

表3 各组小鼠脑组织炎症细胞因子水平比较（pg/g，）

注：对照组及模型组给予50 mg/kg 生理盐水灌胃；盐酸氟西汀组给予2.6 mg/kg 盐酸氟西汀灌胃；槲皮素组给予50 mg/kg 槲皮素灌胃；贯叶金丝桃提取物组给予50 mg/kg 贯叶金丝桃提取物灌胃；槲皮素联合贯叶金丝桃提取物组给予槲皮素联合贯叶金丝桃提取物各50 mg/kg 灌胃；IL-6 为白介素-6；IL-10 为白介素-10；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与盐酸氟西汀组和槲皮素组比较，cP＜0.05；与贯叶金丝桃提取物组比较，dP＜0.05

3.4 各组小鼠脑组织单胺类神经递质水平比较 对照组及槲皮素联合贯叶金丝桃提取物组小鼠脑组织DA、NA 水平明显高于模型组、盐酸氟西汀组、槲皮素组、贯叶金丝桃提取物组（P 均＜0.05），槲皮素组、盐酸氟西汀组、贯叶金丝桃提取物组小鼠脑组织DA、NA 水平均高于模型组（P 均＜0.05），贯叶金丝桃提取物组小鼠脑组织DA、NA 水平明显高于槲皮素组、盐酸氟西汀组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 各组小鼠脑组织单胺类神经递质水平比较（ng/g，）

表4 各组小鼠脑组织单胺类神经递质水平比较（ng/g，）

注：对照组及模型组给予50 mg/kg 生理盐水灌胃；盐酸氟西汀组给予2.6 mg/kg 盐酸氟西汀灌胃；槲皮素组给予50 mg/kg 槲皮素灌胃；贯叶金丝桃提取物组给予50 mg/kg 贯叶金丝桃提取物灌胃；槲皮素联合贯叶金丝桃提取物组给予槲皮素联合贯叶金丝桃提取物各50 mg/kg 灌胃；NE 为去甲肾上腺素；NA 为多巴胺；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与盐酸氟西汀组和槲皮素组比较，cP＜0.05；与贯叶金丝桃提取物组比较，dP＜0.05

4 讨论

槲皮素又称栎精，具有较强的自由基清除能力及抗氧化性，能够捕获自由基预防脂质过氧化反应，对肿瘤具有抑制作用，还具有较强的抗过敏、抗炎、抗菌等生物活性[7]。贯叶金丝桃是藤黄科植物贯叶金丝桃L.的干燥地上部分，其功效为消肿、清热利湿、疏肝解郁。临床常用于治疗心胸郁闷、情志不畅及肝气郁结等。药理研究证实，贯叶金丝桃提取物具有显著的抗抑郁成分，且抗炎镇痛作用明显[6]。胡甜等[8]研究结果显示，槲皮素可有效缩短糖尿病小鼠逃避潜伏期，降低空腹血糖水平。本研究结果提示，槲皮素、贯叶金丝桃提取物及槲皮素联合贯叶金丝桃提取物均能够促使抑郁小鼠糖水偏爱分数明显升高，缩短寻找平台潜伏期的时间，增加所占目标象限百分比，其中槲皮素联合贯叶金丝桃提取物效果更佳。表明槲皮素联合贯叶金丝桃提取物具有更明显的抗抑郁作用。

IL-6、IL-10 等细胞炎症因子在抑郁症中发挥重要的作用。IL-6 可促使星形细胞和小神经胶质细胞激活，诱导其他细胞因子生成，其在抑郁症患者中呈高表达[9]。IL-10 对促炎性细胞因子具有抑制作用，可抑制炎症反应的发生，其水平降低会促使抑郁症的发生，诱导炎症细胞因子水平上升，致使严重抑郁症的发生[10]。本研究结果显示，槲皮素、贯叶金丝桃提取物及槲皮素联合贯叶金丝桃提取物能够降低抑郁小鼠炎症因子水平，其中槲皮素联合贯叶金丝桃提取物降低抑郁小鼠炎症因子水平更明显。

既研究证实，抑郁症大鼠会导致海马组织DA、NA 水平降低，提示抑郁症与中枢NA 功能下降相关；另外，DA 通络与情绪反应密切相关，其水平降低与抑郁症发生、发展密切相关，其水平越低，则抑郁症状越明显[11]。贯叶金丝桃提取物对DA 在摄取具有抑制作用，神经递质减少对突触前膜的重吸收，致使神经递质的合成和释放增加，从而能够增加其在突触间隙的浓度[7]。本研究结果显示，槲皮素、贯叶金丝桃提取物及槲皮素联合贯叶金丝桃提取物能够升高抑郁小鼠脑组织中单胺类神经递质水平，具有抗抑郁的作用，其中槲皮素联合贯叶金丝桃提取物抗抑郁水平更明显。

总之，槲皮素联合贯叶金丝桃提取物能够促使抑郁小鼠糖水偏爱分数明显升高，缩短寻找平台潜伏期的时间，增加所占目标象限百分比，减低炎症细胞因子水平，增加单胺类神经递质水平发挥抗抑郁作用。