乳与乳制品中黄曲霉毒素检测研究进展

张振宇，王 勇

(1.河南省济源市畜产品质量监测检验中心，济源 459000；2.河南省信阳市畜产品质量检验监测中心，信阳 464000)

黄曲霉毒素(aflatoxin，AF)是Ⅰ类致癌物质，饲料很容易被黄曲霉毒素污染[1]，奶牛在摄入含有黄曲霉毒素的饲料后，会导致奶牛出现免疫力下降和营养不良等问题，给奶农带来严重损失[2-3]。黄曲霉毒素主要有B族(AFB1、AFB2)、M族(AFM1、AFM2)和G族(AFG1、AFG2)，其中AFB1在所有的黄曲霉毒素中毒性最强，AFM1会以AFB1的代谢物形式进入生乳与乳制品中，AFB1作用的靶器官是肝脏，是导致肝癌形成的主要致癌物质之一[4-5]。目前常见的检测黄曲霉毒素残留方法有质谱法[6]、电化学法[7-8]、光谱法[9]、色谱法[10-11]、试纸条法[12]等。作者介绍了近5年来国内外上述方法在检测乳与乳制品中黄曲霉毒素残留中的应用。

1 质谱法

质谱法具有检测精度高、重现性好等特点，因此GB 5009.24—2016《食品中黄曲霉毒素M族的测定》与GB 5009.22—2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》均采用了质谱法来检测黄曲霉毒素。借助黄曲霉毒素的同位素内标物可以实现黄曲霉毒素的精准分析，质谱法是科研工作者在对黄曲霉毒素定量分析时的首选检测方法。

合适的前处理方法可以提高质谱法检测黄曲霉毒素的准确度，目前的研究都集中在寻找适当的提取剂来提取乳与乳制品中的黄曲霉毒素。宗万里等[13]开发了一种无需免疫亲和柱净化与浓缩步骤的前处理方法，通过在液态乳中加入乙腈涡旋振荡离心，上清液过滤后直接进质谱检测AFM1，该法成本低、速度快，适合大批量样品的快速检测。Zhang等[14]合成了一种新型、特异性的诱导剂功能化的吸附剂，当向牛奶样品中加入该吸附剂与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)后，吸附剂可以特异性地与AFM1结合，通过固相萃取柱萃取与洗脱后便可以进行质谱检测。华宇等[15]使用MycoSepTM226 AflaZon+Multifunctional净化柱来净化通过甲醇提取的乳与乳制品样品上清液，并利用同位素内标进行基质校正，该法净化过程快速，检验效率得到了很大的提升。Du等[16]分别使用十八烷基三甲氧基硅烷功能化的二氧化硅颗粒和甲醇作为吸附剂和解吸溶剂来净化、富集牛奶中的AFM1和AFB1，在使用质谱对AFM1和AFB1残留进行检测时均取得了良好的结果。Mehta等[17]使用含2%甲酸的低温乙腈来提取牛奶中的AFM1、AFM2、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2残留，在经过10 min的水浴与5 min的低温冷藏后，通过离心、干燥、复溶等步骤得到上机溶液，利用超高效液相色谱串联质谱的选择反应监测模式来检测黄曲霉毒素残留。曹叶中等[18]开发了一种快速、廉价的前处理方法用于提取、净化乳与乳制品中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1，使用含0.5%乙酸的乙腈-水溶液作为提取溶剂，通过加入硫酸镁和氯化钠来促进乙腈-水分层，最后利用正己烷除脂便可用液相色谱串联质谱仪进行检测。张俊等[19]使用甲醇提取牛奶样品中的AFM1，经过涡旋、离心、水稀释后利用免疫亲和柱进行净化，以乙腈或甲醇作为洗脱剂，在优化的试验条件下，试验结果可以满足乳中AFM1检测的灵敏性需求。除了直接检测黄曲霉毒素，还可以通过其他方法间接定量黄曲霉毒素。Pérez等[20]利用电感耦合等离子体质谱开发了一种免疫分析方法用于检测牛奶中的AFM1，该法基于间接生物素化的抗体和与链霉菌素结合的金纳米粒子，当体系变成酸性时，金纳米粒子游离出来从而被电感耦合等离子体质谱检测，从而间接得到AFM1的定量信息。以上各种方法的线性范围、检出限和回收率见表1。

表1 不同质谱法在检测黄曲霉毒素中的线性范围、检出限和回收率

在使用免疫亲和柱、黄曲霉毒素同位素内标物和质谱法检测乳与乳制品中的黄曲霉毒素时，能获得专一、精确的检测结果，但黄曲霉毒素同位素内标物价格不菲，免疫亲和柱同样造价昂贵，不适合大批量乳与乳制品中黄曲霉毒素的分析检测。因此质谱法检测黄曲霉毒素的研究重点可聚焦外标法、普通固相萃取柱或者磁性吸附材料的开发。

2 电化学法

电化学法具有所用仪器简便、成本低、速度快、灵敏度高等优点，广泛应用于环境、生物、食品检测等领域[21]。电化学法检测黄曲霉毒素多采用间接法，思路之一是黄曲霉毒素与适配体结合成复合物，从而阻碍电极表面电子的传递，导致电化学传感器的电阻变大，借此实现对黄曲霉毒素的定性定量分析[22]；思路之二是在电极表面固定可发生氧化还原反应的物质，当体系中存在黄曲霉毒素时，黄曲霉毒素可将发生氧化还原反应的物质置换出来，从而间接检测黄曲霉毒素[23]。

Ahmadi等[24]分别将还原氧化石墨烯、金纳米颗粒(AuNPs)通过循环伏安法固定到铅笔芯电极表面，然后在经过硫醇改性的适配体溶液中放置60 min得到电化学传感器，该传感器在AFM1存在时电阻会增加，因此可以借助电化学阻抗法来实现对AFM1的检测。Smolko等[25]将玻碳电极(glassy carbon electrode，GCE)置于含中性红(neutral red,NR)、硝酸钾与十羧基苯甲酸基柱芳烃(P[5]A-COOH)溶液中采用循环伏安法循环扫描19.5圈，然后用EDC/NHS将AFM1适配体固定到电极表面制得了一支可特异性检测AFM1的电化学传感器。Shadjou等[26]把石墨烯量子点(GQDs)、α-环糊精(α-CD)和银纳米粒子(AgNPs)固定到玻碳电极表面，然后利用循环伏安法检测AFM1，当AFM1浓度增大时，电流值也相应得到增加，在检测乳中AFM1时效果令人满意。Hamami等[27]在丝网印刷电极(screen-printed carbon electrode，SPCE)表面首先固定上AuNPs，然后固定二茂铁四乙二醇配体(ferrocenetetraethylene glycol ligand，FcTGL)，最后在EDC/NHS的作用下修饰AFM1适配体，借助电化学阻抗法实现了AFM1的灵敏分析。Rahmani等[28]采用静电纺丝和热处理的方法制备了静电纺丝碳纳米纤维，并将其直接用作新型衬底电极，接着利用电沉积的方法将AuNPs固定到电极表面，最后将经过硫醇修饰的单链DNA修饰到电极表面制得了可特异性检测AFM1的电化学传感器。Abera等[29]使用电路板打印机分别将银糊制作的工作电极和对电极与银/氯化银糊制作的参比电极打印在125 μm厚的聚对苯二甲酸乙二醇酯基片上，在120 ℃条件下固化15 min后，使用喷雾沉积装置将单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotube,SWCNTs)均匀地喷涂在工作电极的顶部，最后固定上适配体后制备了一支检测AFM1的电化学传感器。Aissa等[30]利用基于二茂铁和硅纳米粒子(SiNPs)的适配体、丝网印刷电极构建了一支可以灵敏检测AFM1的电化学传感器，在利用循环伏安法与电化学阻抗法检测牛奶中的AFM1时效果良好。Karczmarczyk等[31]首先通过自组装原理将巯基丙酸固定到覆金的丝网印刷电极表面，接着在EDC/NHS作用下固定牛血清蛋白-AFM1结合物，最后将电极在乙醇胺溶液中浸泡去除未结合的牛血清蛋白-AFM1，该传感器可用于牛奶中AFM1的灵敏度检测。表2是以上电化学法在检测黄曲霉毒素应用中的线性范围、检出限和回收率。电化学法在检测乳与乳制品中的AFM1时具有灵敏度高、线性范围宽、检出限低、耗费低等优点，但不容忽视的是电化学法的稳定性与重现性较差，而且难以实现多种黄曲霉毒素的同时检测。

3 光谱法

目前已有研究人员使用光谱法来检测食品中的黄曲霉毒素，如荧光光谱法[32]、红外光谱法[33]，随着研究的深入，荧光光谱法、红外光谱法都被用于检测乳与乳制品中的黄曲霉毒素，且取得了良好的结果。

3.1 荧光光谱法

Li等[34]利用简单的水热法合成了高发光率氮掺杂的碳点，其量子产率达到97.1%，通过使用合成的碳点和碱性磷酸酶研制了一种基于碳点内滤效应的无标记免疫传感器，用于牛奶中AFM1的超灵敏度检测，检出限低至0.0186 ng/mL，线性范围为79.6%～112.5%，高量子产率的碳点对提高传感器的灵敏度起到了重要的作用。郭婷等[35]将羧基荧光素修饰的适配体作为识别元件，使用具有猝灭性和磁分离性能的磁性Fe3O4纳米材料作为荧光猝灭剂，当体系中存在AFM1时，羧基荧光素修饰的适配体从Fe3O4表面脱附，使体系的荧光信号增强，基于此来检测牛奶中的AFM1，该法对AFM1的检出限为0.02 μg/L，线性范围为0.05～0.70 μg/L，在检测牛奶样品中AFM1的回收率为82.5%～102.3%。Li等[36]通过晶种生长法合成了尺寸为33 nm的钯纳米粒子，基于5-羧基荧光素和钯纳米粒子之间的荧光共振能量转移建立了检测AFM1的方法，整个体系使5-羧基荧光素荧光猝灭最大程度达到95%，而且钯纳米粒子对荧光素的非特异性荧光猝灭作用可以忽略不计，优化试验条件后，AFM1的检出限为1.5 pg/mL，线性范围为5～150 pg/mL,在检测牛奶样品中AFM1的回收率为92.0%～106.5%。Jia等[37]利用季胺化四苯基乙烯盐、氧化石墨烯和AFB1适配体构建了一支无标记的荧光适配体传感器，该传感器对AFB1的检出限为0.25 ng/mL，线性范围为0～3 ng/mL，在检测牛奶中的AFB1时线性范围为91.36%～91.89%，该法无需荧光素进行标记，简化了试验流程。Guo等[38]首先利用羧基荧光素标记核酸适配体，然后加入氧化石墨烯用来熄灭羧基荧光素标记核酸适配体的荧光，氧化石墨烯还可以保护核酸适配体不被核酸酶裂解，当加入AFM1后，AFM1会与适配体结合形成复合物从而导致适配体从氧化石墨烯表面脱离，在酶的作用下核酸适配体裂解，荧光素标记的核酸适配体重新发光，实现了信号放大，AFM1的线性范围为0.2～10 μg/kg，检出限为0.05 μg/kg，方法的回收率在92%～126%。Niazi等[39]将KYF4:Eu3+时间分辨荧光纳米颗粒作为信号探针，石墨相氮化碳(g-C3N4)纳米片作为荧光猝灭剂，并结合滚环扩增技术提高检测的灵敏度，检出限达到了0.0194 pg/mL，线性范围为0.0001～0.5 ng/mL，线性范围为92.0%～99.8%，在AFB1与AFB2同时存在的条件下，AFM1的检测基本不会受到干扰，具有良好的抗干扰能力。Zhou等[40]合成尺寸为150 nm的量子点珠作为竞争抗原的载体，大尺寸的量子点珠可以降低竞争抗原对抗体的结合亲和力，进而增强荧光信号强度，使用AFB1与牛血清蛋白在量子点珠表面进行标记，结合酶联免疫与荧光法来检测巴氏消毒奶、酸奶和奶粉中的AFM1，检出限分别为0.5、0.6、0.72 pg/mL。Qiao等[41]利用羧基荧光素修饰核酸适配体，其互补DNAs使用羧基四甲基罗丹明淬灭基团修饰，在没有AFM1的情况下，核酸适配体和互补DNAs杂交，由于核酸适配体的荧光基团靠近互补DNAs的猝灭基团，导致核酸适配体的荧光猝灭，当加入AFM1后，AFM1与核酸适配体形成结合物，核酸适配体结构的改变导致荧光信号出现，在最佳的试验条件下，AFM1的检出限为0.5 ng/mL，线性范围为1～100 ng/mL，在检测牛奶样品中AFM1的回收率为93.4%～101.3%。

3.2 红外光谱法

Jha等[42]通过使用傅里叶变换红外分光光度计检测分别添加10、20、30、40、50 μL/L AFB1的牛奶样品，发现在1 484～1 423 cm-1的波数范围内可以明显观察到吸光度的变化，基于此，结合化学计量学建立了定量检测AFB1的方法。该研究小组使用同样的方法研究了红外光谱法在检测AFM1中的应用，试验发现在1 800～650与3 689～3 499 cm-1波数范围内，空白牛奶与添加了AFM1的牛奶的光谱图存在显著差异，该法可检测浓度低至0.02 μg/L的AFM1[43]。红外光谱法检测黄曲霉毒素无需对样品进行前处理，仅需制片便可进行检测，与质谱仪和色谱仪相比，红外光谱仪价格也更便宜，研究人员可进一步探索合适的红外光谱法用于检测黄曲霉毒素。

3.3 其他光谱法

Lerdsri等[44]基于局域表面等离子体共振原理，结合AuNPs研制了一种无标记的比色传感器用于检测AFM1，该传感器在氯化钠存在的条件下利用适配体与AFM1和AuNPs的聚集效应，由聚集AFM1的体系表面等离子体共振峰移导致溶液由红色变成紫色乃至深蓝色，可以用比色法测定样品中的AFM1，该传感器的检出限为0.002 ng/mL，线性范围为0.005～0.100 ng/mL，在检测牛奶中AFM1的回收率为80.5%～89.7%。Fang等[45]使用链霉亲和素来链接生物素化的AFM1单克隆抗体与生物素化的氧化石墨烯，在葡萄糖与I-发生氧化反应后，生成的I2蚀刻十六烷基三甲基溴化铵标记的金纳米棒导致局域表面等离子体共振峰发生改变，使溶液的颜色从蓝色变成粉色，在使用紫外光谱法检测AFM1时检出限为0.11 ng/mL，线性范围为0.25～10 ng/mL，回收率为90.33%～102.02%，该法具有良好的特异性及准确度。Jalalian等[46]以适配体作为识别探针，AuNPs作为比色指示剂，基于链霉亲和素包覆的二氧化硅纳米颗粒、AuNPs和适配体的互补链设计了一种比色适体传感器，在此方法中，AFM1适配体及其互补链均通过链霉亲和素与生物素之间的相互作用附着在二氧化硅纳米颗粒表面，当溶液中存在AFM1时颜色为红色，随着AFM1浓度的降低，溶液颜色会逐渐变为紫色，该法检测AFM1时线性范围较宽，达到了300～75 000 ng/L，对检测高、低浓度的AFM1残留均有效，检出限为30 ng/L。Tsounidi等[47]研制了一种基于白光反射光谱的微型光学免疫传感器用于奶样品中AFM1的快速免标记检测，白光反射光谱传感系统由测量装置和生物芯片组成，测量装置包括反射探针、光源和光谱仪，生物芯片是固定AFM1-牛血清蛋白结合物的SiO2层的硅芯片，该法检出限为6 pg/mL，线性范围为0.012～2.0 ng/mL，该法可检测不同动物品种的加工和未加工奶中的AFM1，且样品不需稀释。

光谱法在检测乳与乳制品中黄曲霉毒素时具有特异性高、检测速度快等优点，但是其适体传感器制作步骤繁琐、需要使用DNA试剂等限制了光谱法在检测乳与乳制品中黄曲霉毒素的应用。

4 色谱法

GB 5009.22—2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中采用了高效液相色谱-柱前衍生法、高效液相色谱-柱后衍生法以及薄层色谱法来检测食品中的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，GB 5009.24—2016《食品中黄曲霉毒素M族的测定》同样利用高效液相色谱法来检测AFM1和AFM2。目前已有研究人员开发了液相色谱法用于检测乳与乳制品中的黄曲霉毒素[48-49]。

Hamed等[50]结合分散液液微萃取和QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)技术，利用高效液相色谱-荧光法开发了同时检测乳与乳制品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的方法，并研究了该方法对8种不同的乳与乳制品中黄曲霉毒素检测效能，在优化的试验条件下，方法的回收率为82%～104%。Shuib等[51]首先使用AFLATEST免疫亲和柱去除样品中的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，然后利用Hypersil gold C18柱分离AFM1，结果发现，当甲醇代替乙腈作为流动相时，AFM1的峰面积提高了67%，在使用柱后光化学衍生法检测AFM1时检出限从0.013 μg/L降至0.002 μg/L，线性范围为0.004～0.500 μg/L。Shuib等[52]利用注射器内分散微固相萃取-高效液相色谱-荧光法建立了一种同时检测AFB1、AFB2、AFM1和AFM2的方法，该法使用Hypersil gold C18色谱柱在40 ℃条件下对黄曲霉毒素进行分离，在优化的试验条件下，4种黄曲霉毒素可在35 min内完全分离，检出限分别为0.005、0.003、0.004、0.004 ng/mL，回收率为73.0%～109.6%。

色谱法在检测乳与乳制品中黄曲霉毒素的应用中具有前处理简便、可同时检测等优点，但色谱法也存在检测时间长、低浓度黄曲霉毒素的峰形不好等缺点，以后可重点研究寻找合适的流动相用于分离黄曲霉毒素。

5 试纸条法

试纸条法具有特异性好、检测费用低、检测时间短等优点，在食品检测、生物与生命分析等领域有着十分重要的应用。在检测乳与乳制品中的黄曲霉毒素时，试纸条法可在现场进行大批量样品的筛查，当出现阳性样品时再利用质谱法进行确认，可极大地提高检测效率并降低检测费用。

Su等[53]利用红色的聚乙烯亚胺/聚苯乙烯磺酸钠((PEI/PSS)4)复合二氧化硅纳米颗粒标记AFM1单克隆抗体制作了免疫层析检测试纸条用于牛奶中AFM1的灵敏检测，在优化单克隆抗体的条件与免疫探针的用量后，该试纸条在检测牛奶中AFM1的检出限低至0.1 pg/mL，具有优秀的灵敏度。Han等[54]制备了特异性的单克隆抗体和受体，并与AuNPs结合形成8个抗体/受体偶联物作为检测探针，然后合成了8个相应的半蛋白偶联物，并将其固定在硝化纤维素膜上作为捕获抗原，实现了一支试纸条可同时检测8种药物残留，在检测AFM1时检出限为0.016 ng/mL。Li等[55]利用时间分辨荧光微球免疫层析试纸条快速检测乳与乳制品中的AFM1，用聚苯乙烯微球包封荧光纳米微球铕(Ⅲ)作为标签，然后将其结合到单克隆抗体上，在优化的试验条件下，半数抑制浓度为0.204 ng/mL，检出限为0.019 ng/mL，随着AFM1含量的增加，检测线的荧光强度降低，该法的线性范围为0.05～2.0 ng/mL。蔡芬等[56]制备了胶体金单克隆抗体复合物，使用包被原作为T线，羊抗鼠二抗作为C线，在优化了偶联过程抗体的添加量和偶联过程偶联pH后用于检测牛奶样品中的AFM1，线性范围为0.01～1.00 μg/L，检测限为0.05 μg/L，检测时间为10 min。Kasoju等[57]基于微流控纸的分析装置制备了免疫试纸条用于检测牛奶中的AFM1，方法使用未修饰的AuNPs作为探针、21-mer适配体作为识别分子，在没有AFM1的情况下，即使在高盐浓度下，游离适配体也能吸附在AuNPs表面，当存在AFM1时，盐能够诱导特异性适配体聚集，在最佳试验条件下检测牛奶中的AFM1时，检出限为10 nmol/L，活性长达3个月。

试纸条法检测乳与乳制品中黄曲霉毒素时无需对样品进行繁琐的前处理，也不需要专用的仪器，而且检测时间非常短，对检测人员要求较低，因此十分适合大批量样品的快速筛查及现场检测。但试纸条法适合定性检测，定量检测性能的欠缺限制了试纸条法的发展，今后试纸条法与读数仪相结合是发展的趋势[58]。

6 其他方法

Giovanni等[59]开发了一种直接检测全脂牛奶中微量AFM1的传感器检测方法，首先合成了AFM1单克隆抗体，然后将单克隆抗体与酿酒酵母菌的转化酶结合，当牛奶中存在AFM1时，酿酒酵母菌的转化酶被置换出来，把蔗糖转化成果糖和葡萄糖，可通过血糖计测量产生的葡萄糖来间接实现AFM1的定量检测，该法可检测最低浓度为27 μL/mL的AFM1。Yao等[60]以辣根过氧化物酶催化鲁米诺化学发光反应为基础，使用杂交链式反应信号放大策略用于提高检测灵敏度，磁性材料分离技术的应用可以进一步降低背景信号，在使用化学发光法检测AFM1时，线性范围为0.5～40 ng/mL，检出限为0.2 ng/mL，在检测牛奶样品中AFM1的回收率为98.2%～104.4%。

7 展 望

以上综述了质谱法、电化学法、光谱法、色谱法、试纸条法等在检测乳与乳制品中黄曲霉毒素的最新研究进展，表3总结了以上各种方法在检测乳与乳制品中黄曲霉毒素中的优势及其面临的挑战。

表3 不同方法在检测乳与乳制品中黄曲霉毒素的优势与挑战

开发新的检测乳与乳制品中黄曲霉毒素的方法可以包括以下几个方面：①开发特异性好、灵敏度高的试纸条用于样品初筛，并将试纸条与读数仪结合，可快速、简便地得到乳与乳制品中黄曲霉毒素的残留量，实现在线快速检测，在原料乳验收时进行快速判定具有重大意义；②精准检测方面，开发不需要免疫亲和柱的前处理方法用于分离和富集乳与乳制品中的黄曲霉毒素，利用质谱法与色谱法便于实现自动化的优势可以大批量精确定量乳与乳制品中黄曲霉毒素；③开发性能稳定、制作方法简单的适配体传感器和修饰电极分别用于光谱法和电化学法来检测乳与乳制品中的黄曲霉毒素，可以显著降低黄曲霉素检测成本。