听性稳态反应在不同类型听力损失儿童听力筛查中的应用研究

孙蕾 李莹莹 谢园

我国《新生儿听力筛查技术规范》中明确规定[1]，所有听力筛查未通过的婴儿最迟应在出生后3个月内接受全面的听力学评估，诊断为永久性听力损失的婴儿应尽快接受早期医学治疗，最迟不超过6月龄。先天性听力损失是由遗传因素导致的疾病，临床常见合并先天性聋哑，严重影响患儿的生长发育，是我国产前筛查和遗传预防的重要内容[2]。经国内外多项大宗流行病学调查显示[3，4]，单位点核苷酸结构突变在先天性耳聋中发生率较高，是主要的基因突变类型。通过检测外周血微量全基因组DNA序列能够快速、高效、精准判断突变位点和类型，已在产前筛查和基因诊断中广泛应用[5]。听力损失的类型主要包括传导性、感音神经性和混合性，诱发原因和具体临床表现有较大差异，临床治疗措施也有区别，需要谨慎对待[6]。听力检查是诊断听力损失、评估损失程度以及鉴别损失类型的主要依据，主要包括短声诱发听性脑干反应（Click-ABR）、分频听性脑干反应（chirp-ABR）、听性稳态反应（ASSR）和纯音听阈（PTA）等[7，8]。本研究主要分析ASSR和click-ABR在不同类型听力损失儿童听力筛查中的应用价值。

1 对象与方法

1.1 对象

选择2020年1月～2021年6月我院诊断为先天性听力损失儿童222例，出生时间60～180天，男134例，女88例。纳入标准：①能够顺利完成各项听力测试，听阈数据可分析；②取得患儿监护人的知情同意，符合医学伦理学要求；③未行任何药物治疗或植入人工耳蜗。排除标准：①耳外伤未愈；②耳内感染性疾病未愈；③先天发育性疾病、缺血缺氧性脑病。

1.2 基因突变检测

抽取足跟血2～3 ml，采用博奥生物集团有限公司的基因组DNA提取和检测试剂盒，应用微阵列芯片法检测4个常见耳聋基因的15个分型，根据说明书提示步骤依次完成PCR扩增、芯片杂交、扫描和结果判读。15个位点包括GJB2（35delG、176del16、235delC和299delAT）、GJB3（538C＞T）、SLC26A4（2168A＞G、IVS7-2A＞G、1174 A＞T、1226 G＞A、1229 C＞T、1975 G＞C、2027 T＞A和IVS15+5 G＞A）和线粒体12S rRNA（1494C＞T和1555A＞G）。

1.3 听力检查

纯音测听在标准隔声室内进行，采用尔听美奥德1081一型听力计，B71型骨导耳机、ME70气导耳机，按照GB/T16403-1996标准。测试时采用“升五降十”法，先用气导耳机给声测试双耳未加掩蔽的气导听力，记录双耳0.25～8 kHz倍频程听阈，然后测试双耳加掩蔽的骨导听力，记录 0.25～4 kHz倍频程听阈。click-ABR和ASSR测试在标准电磁屏蔽室内进行，本底噪声≤25 dB，测试前予患儿10%水合氯醛溶液灌肠进入稳定睡眠后开始检测。click-ABR测试采用俄罗斯Neuro-Audio听觉诱发电位仪，前额发际放置记录电极，鼻根部放置地电线，两侧乳突部放置参考电极，保证极间电阻≤4 kΩ，采用 ER-3A插入式耳机给声，刺激声为短声，刺激速率21.1次/d ，叠加次数1024次，记录时间窗15 ms，带通滤波100～3000 Hz，每个强度至少重复3次，刺激强度从80 dB nHL开始，每20 dB递减，以click-ABR波V反应阈值≤30 dB nHL为正常标准，0 dB nHL＝28.7 dB SPL。ASSR测试准备和电极安放同click-ABR，骨振器放置耳乳突处，气导较好耳使用ER-3A插入式耳机进行掩蔽，掩蔽声为白噪声，强度为骨导给声强度上加 30 dB SPL，气导ASSR测试载频为 0.5、1、2和4 kHz，调制频率为左耳77、85、93和101 Hz，右耳79、87、95、103 Hz，系统自动判定各频率阈值。

1.4 观察指标

检测患儿外周血4个耳聋基因的突变情况，将患儿分为基因突变组与无基因突变组；根据听损类型分为传导性、感音神经性和混合性3组，比较各组患儿性别、年龄、听力检查click-ABR和ASSR反应阈，判断听力损失程度。平均听力损失26～40 dB为轻度，41～60 dB为中度，≥61 dB为重度。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素ANOVA分析和LSD-t法检验；计数资料[例(%)]比较用χ2检验；Spearman检验分析Click-ABR和ASSR反应阈的相关性；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因突变与无基因突变组听力情况比较

105例患儿（47.3%，105/222）耳聋基因突变，其中GJB2基因突变40例、GJB3突变14例，SLC26A4突变34例，线粒体12S rRNA突变12例，双位点突变5例。基因突变组与无基因突变组比较，听力损失程度增加，在0.5、1、2和4 kHz频率下Click-ABR和ASSR反应阈均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；患儿性别和年龄比较差异不明显（P＞0.05），见表1。基因突变组与无基因突变组各频率下Click-ABR和ASSR反应阈均有较好的相关性（P＜0.05），见表2。

表1 基因突变与无基因突变组听力情况比较

表2 基因突变与无基因突变组Click-ABR 和ASSR 反应阈的相关性

2.2 不同听损类型组听力情况比较

222例患儿中传导性聋74例、感音神经性聋82例和混合性聋66例。混合性组与传导性和感音神经性聋比较，听力损失程度增加，在0.5、1、2和4 kHz频率下ASSR和Click-ABR反应阈均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；传导性聋和感音神经性聋组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。3组患儿性别和年龄比较差异不明显（P＞0.05），见表3。混合性、传导性和感音神经性聋组各频率下Click-ABR和ASSR反应阈均有较好的相关性（P＜0.05），见表4。

表3 不同听力受损原因组听力情况的比较

表4 不同听力损失原因组Click-ABR 和ASSR 反应阈的相关性

3 讨论

我国每年都有大量新生儿通过出生时或出生后3天内采集足跟血筛查致聋易感基因或常见基因。但主要致聋基因的筛查受地域、种族、患病家族以及调查样本量大小的影响[9]。本研究主要检测4个耳聋基因（GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体12S rRNA）15个常见突变位点，显示耳聋基因的突变率高达47.3%，其中GJB2、SLC26A4和线粒体12S rRNA的单位点突变率居多。韩跃峰等[10]检测了江淮地区128例极重度感音神经性聋患者显示，基因突变率为36.72%，其中GJB2基因突变最多见。Wen C等[11]对2016～2017年我国多地区新生儿耳聋基因的筛查现状进行调查显示，筛查率为36.59%（15/41），发病率最高的是东部地区（72.22%，13/18），4个基因中9个变异体和20个变异体所占比例最高，均为33.33%（4/12），其次是15个变异体（25%，3/12）和5个变异体（8.34%，1/12）。共有340521名新生儿筛查阳性率为5.00%，其中GJB2基因单杂合突变率为2.43%（8269/340521），双等位突变率为0.02%（56/340521），SLC26A4基因单杂合突变率为1.99%（6771/340521），双等位突变率为0.01%（39/340521），GJB3基因单杂合突变率为0.33%（1140/340521），线粒体12SrRNA基因突变率为0.22%（746/340521），双基因杂合突变率为0.004%（15/340521）。可见中国东部地区新生儿耳聋基因筛查比中西部地区更广泛，4个基因中9个变体和20个变体被广泛使用，GJB2和SLC26A4基因突变最常见。

本研究发现，基因突变组比无基因突变组患儿的听力损失程度增加，在0.5、1、2和4 kHz频率下click-ABR和ASSR反应阈均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；患儿性别和年龄比较差异不明显（P＞0.05）。提示耳聋基因突变阳性的患儿听力损失更严重。由基因突变导致的先天性耳聋患儿往往需要尽早植入人工耳蜗，以改善听力，减轻耳聋导致的身体发育障碍[12，13]。不同致聋基因突变影响听力发育的机制不同。GJB2属常染色体隐性遗传基因，其编码Cx26 与相邻细胞的缝隙连接蛋白组成完整的缝隙连接通道，调控细胞间的钾离子水平维持细胞间信号转导[14]。GJB2单位点突变率高，全国平均突变率为11.8%，占所有GJB2基因突变的67.7%[15]。SLC26A4属常染色体隐性遗传基因，编码Pendrin蛋白进行多种离子成分的跨膜转运，与大前庭导水管综合征和内耳畸形的产生关系密切[16]。线粒体12S rRNA属母系遗传基因，对氨基糖苷类抗菌药物有极高的敏感性。该基因突变使蛋白质合成中与氨基糖苷类药物形成结合位点，影响蛋白质的合成[17]。但本研究尚不能确定听力检查如ASSR能够用于鉴别致聋基因突变。

本研究发现，混合性听力损失组与传导性和感音神经性聋组比较，听力损失程度增加，在0.5、1、2和4 kHz频率下ASSR和click-ABR反应阈均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；传导性和感音神经性患儿组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。3组患儿性别和年龄比较差异不明显（P＞0.05）。提示混合性听力损失患儿的听力损失更严重。ASSR是评价人工耳蜗受试者听阈的较好方法[18]。ASSR能够对振幅调制的连续音调进行自动客观评价，激发ASSR刺激可以通过空气传导（插入式耳机或扬声器）、骨传导（骨振动器）或电传导（耳蜗植入受试者），使用耳机产生的ASSR已进行广泛研究，能够提供合理可靠的听力阈值估计值[19]。本研究采用此种方法获得ASSR反应阈。发现无论是基因突变组还是无基因突变组，混合性、传导性和感音神经性聋组在各频率下click-ABR和ASSR反应阈均有较好的相关性（P＜0.05）。提示ASSR和click-ABR具有较好的稳定性，可以相互补充，对残存听力较低的患儿能够尽可能多的评估听力情况，做出准确的病情判断。