具有抑菌活性植物乳杆菌的筛选及抑菌物质特性的研究

翟佳琳，赵景娜，王丹丹，扎木苏，陈永福

(内蒙古农业大学，乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特，010018)

食品安全问题一直影响着世界各国的公共卫生，制约着食品工业的发展，其中食源性致病菌的污染是食品安全主要挑战之一。大肠杆菌O157:H7是世界上最常见的食源性致病菌之一，它通过污染食物感染人体，感染剂量极低(约50 CFU)，具有耐热性、耐酸性和高度的传染性，导致感染者出现出血性腹泻、肠炎甚至溶血性尿毒综合征[1]。这种致病菌存在于恒温动物的消化道中，通常随粪便排泄到环境中，对营养缺乏、极端pH值和低温等环境胁迫具有很强的耐受性[2]。因此，大肠杆菌O157:H7广泛分布于水和土壤中，大多数食品易受其污染，目前，防控食品中大肠杆菌生长最常见的方法是使用合成和天然的抗生素[3]。

但是，根据欧洲抗生素耐药性监测网络(European Antimicrobial Resistance Surveilance Network，EARS-Net)报告显示，在2013～2016年，大肠杆菌对头孢菌素的耐药性以及对头孢菌素、氟喹诺酮类和氨基糖苷类药物的联合耐药性大幅增加[4]。因此许多常见的感染正在变得严重甚至无法控制，从而导致更长时间的疾病和更高的死亡率[5]。鉴于消费者对感染大肠杆菌和抗生素耐药性负面影响的认识日益增强，人们对开发可用于食品工业的天然抗菌剂的兴趣与日俱增。

因此，寻找具有广谱抑菌活性和较高稳定性的新型天然抗菌剂对开发抗生素替代品至关重要。泡菜作为一种常见的中国传统发酵食品，是具有抑菌活性的植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)的重要来源。近年来，研究者们筛选出了一些抑菌活性较强的植物乳杆菌，如植物乳杆菌A2和其他菌株共培养可以抑制白色念珠菌[6]，植物乳杆菌D1和D2对肠沙门氏菌有明显的抑制作用[7]。还有一些研究者发现植物乳杆菌通过产生细菌素等抗菌物质，抑制病原菌在肠道内的黏附和定植来拮抗病原体[8]。根据植物乳杆菌安全无害的特性，有潜力成为天然抗菌剂的合适候选者[9]。

本文从源于四川泡菜的114株植物乳杆菌中筛选对大肠杆菌O157：H7具有较高拮抗活性的菌株，并研究其所产抑菌物质的抑菌特性，为其进一步分离纯化和应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用到的114株植物乳杆菌均由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室前期从四川省泡菜样品中分离鉴定并保藏。

指示菌：大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、乳酸菌均由本实验室保藏；福氏志贺菌、产气荚膜梭菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、蜡状芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌，中国工业微生物菌种保藏管理中心。

MRS肉汤培养基，英国赛默飞公司；LB肉汤、营养肉汤、BHI培养基，广东环凯微生物科技有限公司；过氧化氢酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，上海瑞永生物科技有限公司；脂肪酶，德国西格玛公司；十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、Triton X-100、EDTA，北京索莱宝科技有限公司；其他药品及试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器及设备

SW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空气净化有限公司；5810R高速冷冻离心机，德国艾本德股份有限公司；FE28 pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；MLS-3751L全自动高压灭菌锅，日本三洋；LRH-250电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；HH-21-6电热恒温水浴锅，天津知春科技有限公司；SpectraMax M2多功能酶标仪，美谷分子仪器。

1.3 实验方法

1.3.1 具有抑菌活性植物乳杆菌的筛选

1.3.1.1 无细胞上清液的制备

将供试菌株从装有体积分数30%甘油的冻存管中接种至MRS培养基中，于37 ℃培养24 h，以体积分数2%的接种量连续活化至第3代，培养18 h后，将菌液以8 000×g离心10 min，弃除菌体，所得上清液保存于4 ℃冰箱，用于后续实验。

1.3.1.2 牛津杯双层平板法抑菌实验

把保存在体积分数30%甘油中的指示菌传代至LB肉汤中，于37 ℃、235 r/min的摇床中培养12 h，用生理盐水将指示菌稀释成106CFU/mL的菌悬液。在平板中倒入10 mL体积分数为1.5%的素琼脂，凝固后放置适量牛津杯，将菌悬液与15 mL(含体积分数0.6 %琼脂)的MRS肉汤混匀后倒入平板，置于超净工作台中30 min后，用镊子拔出牛津杯，每孔加100 μL样品。平板置于37 ℃培养12 h，测量并记录抑菌圈。

1.3.1.3 有机酸的排除实验

使用1.3.1.1所述方法制备植物乳杆菌上清液，用3 mol/L的NaOH溶液将上清液的pH值中和至5.5，以未中和的上清液作为对照，用0.22 μm滤器过滤，使用1.3.1.2所述方法进行抑菌实验，并记录抑菌圈。

1.3.1.4 过氧化氢的排除实验

将上清液的pH调至7，加入过氧化氢酶，使过氧化氢酶的终质量浓度达到1 mg/mL，37 ℃孵育2 h后，以未加入过氧化氢酶的上清液为对照，中和排酸后，过0.22 μm滤膜，使用牛津杯双层平板法评估抑菌活性。

1.3.1.5 蛋白类抑菌物质的确定

在上清液中加入蛋白酶K，使酶的终质量浓度为1 mg/mL，37 ℃孵育2 h，以未加蛋白酶K的上清液为对照，中和后用牛津杯法比较处理前后抑菌活性的变化。

1.3.2 抑菌物质的抑菌特性

1.3.2.1 抑菌物质的酸碱稳定性

经1.3.1.1的方法制备植物乳杆菌上清液，取12等份，将每份上清液的pH值分别调至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，对照组不处理，37 ℃孵育2 h后中和排酸，使用牛津杯法测试剩余抑菌活性。

1.3.2.2 抑菌物质的热稳定性

将植物乳杆菌上清液各取7等份，分别在37、50、60、70、80、90、100 ℃孵育30 min，以37 ℃处理的样品为对照，将上清液中和至pH 5.5，用0.22 μm滤器过滤，使用牛津杯法对剩余抑菌能力进行测定。

1.3.2.3 抑菌物质的酶稳定性

将上清液调至各酶的最适工作pH，使每种酶的终质量浓度为1 mg/mL，以蒸馏水代替酶液作为对照组，37 ℃孵育2 h后将pH值调回5.5，测定剩余抑菌活性。

1.3.2.4 表面活性剂对抑菌物质抑菌活性的影响

取pH 5.5的上清液6等份，分别加入SDS、EDTA、尿素、Triton X-100、吐温-80、吐温-20，使各试剂终体积分数为5%或浓度为5 mmol/L，37 ℃孵育2 h，以蒸馏水代替表面活性剂为对照，测试抑菌活性。

1.3.2.5 金属离子对抑菌物质抑菌活性的影响

配制1 mol/L的CaCl2、CuSO4、MnSO4、MgSO4、FeSO4、ZnSO4溶液，与上清液以1∶100的体积比混合，37 ℃孵育2 h后，以未处理的上清液为对照，排酸后测定样品残余的抑菌活性。

1.3.2.6 有机溶剂对抑菌物质抑菌活性的影响

将甲醇、正丁醇、无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇加到pH值为5.5的上清液中，至终体积分数5%，37 ℃孵育2 h，以未处理的上清液为对照，将各样品排酸后测定剩余抑菌活性。

1.3.2.7 不同浓度NaCl对抑菌物质抑菌活性的影响

在上清液中分别加入质量分数为2%、4%、6%、8%、10%、12%的NaCl溶液，以不加NaCl的上清液为对照，中和排酸后测定抑菌活性。

1.3.2.8 紫外照射对抑菌物质抑菌活性的影响

将上清液置于30 W紫外灯下30 cm处，在20、40、60 min时分别取样，以未经紫外处理上清液为对照，中和后测定残余的抑菌活性。

1.3.3 抑菌物质的抑菌谱

使用牛津杯双层平板法制备每种指示菌的含菌平板，将上清液中和排酸后，以不中和的原液为对照，每个孔中加100 μL样品，每种指示菌3个平行，将平板放在培养箱中静置培养，记录最终抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 具有抑菌活性植物乳杆菌的筛选

实验结果表明，114株植物乳杆菌的上清液在未经处理时，pH值在4左右，均可以对大肠杆菌的生长产生很强的抑制作用。当上清液被中和排酸后，98株菌通过有机酸对指示菌进行抑制，仅有16株菌仍有抑菌效果(表1)。

表1 具有抑菌活性植物乳杆菌的筛选结果Table 1 Screening results of L.plantarum with bacteriostatic activity

将中和排酸后仍有抑菌效果的16株菌的上清液使用过氧化氢酶处理后，有13株菌的抑菌效果没有受到影响，说明这13株菌对大肠杆菌产生抑制作用的主要物质并不是过氧化氢，在经过蛋白酶K处理后，植物乳杆菌IMAU80043、IMAU80124、IMAU80144的抑菌活性得到明显降低，其余13株菌的抑菌效果完全消失，证明这16株植物乳杆菌的抑菌物质可以被蛋白酶分解，具有蛋白性质，可以初步推断抑菌物质为抗菌肽。

2.2 抑菌物质的抑菌特性

2.2.1 抑菌物质的酸碱稳定性

优良的物理特性有利于各种抑菌物质在食品保存中的应用，为了筛选产抑菌效果好且抑菌稳定性强的菌株，对3株植物乳杆菌——IMAU80028、IMAU80043和IMAU80122的酸碱稳定特性进行探究。由表1可知， IMAU80028、IMAU80043和IMAU80122的抑菌效果并不来自于过氧化氢，而是经蛋白酶消化后抑菌作用大幅降低甚至完全消失，所以在后续实验中，通过测定中和排酸后上清液的抑菌圈来评估菌株的抑菌活性。如图1所示，IMAU80043所产抑菌物质仅在pH 5和pH 6时具有抑菌活性，IMAU80028则可以耐受pH 4～6，而IMAU80122在pH 3～8时均可以抑制大肠杆菌，在pH 4～5活性最强，随着pH的增高抑菌作用逐渐下降，在较宽的酸性和弱碱性条件下保持良好的抑菌活性。据文献报道，大多数蛋白类抑菌物质(如抗菌肽)都在酸性条件下能够保持稳定，在中性或碱性条件下活性降低甚至丧失[10]，可能是由于抗菌肽分子在碱性pH下会碱裂解，如Nisin[11]。

图1 植物乳杆菌IMAU80122、IMAU80028、IMAU80043所产抑菌物质的酸碱稳定性Fig.1 Acid-base stability of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122, IMAU80028 and IMAU80043注：图中不同字母代表差异显著(P<0.05)(下同)

2.2.2 抑菌物质的热稳定性

由图2可知，IMAU80122的上清液在50、60、70、80 ℃处理30 min后，抑菌物质的剩余活力分别为88.15%、72.18%、60.68%和53.68%，IMAU80043的抑菌物质在70 ℃时就已失去活性，而IMAU80028的抑菌物质无法耐受热处理。一般来说，蛋白质的热稳定性与其分子质量大小成反比，所以推测IMAU80028所产抑菌物质可能为热稳定性差的大分子蛋白。相较于其他2株植物乳杆菌，IMAU80122具有较好的热稳定性，故只选用IMAU80122作为后续实验的供试菌株。

图2 植物乳杆菌IMAU80122、IMAU80028、IMAU80043所产抑菌物质的热稳定性Fig.2 Thermal stability of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122, IMAU80028 and IMAU80043

2.2.3 抑菌物质的酶稳定性

如表2所示，发酵上清液经胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶处理后活性完全丧失，脂肪酶则不起作用，这是该抑菌物质蛋白性质的反映，可以初步判断抑菌物质是某类抗菌肽。但经过胰蛋白酶处理后抑菌活性变化不大，该抑菌物质显示出对胰蛋白酶具有抗性的特点。虽然蛋白类抑菌物质通常对蛋白水解酶敏感，但一些小分子多肽对各种蛋白酶的抗性并不少见[12]，例如，LIU等[13]从唾液乳杆菌BGHO1中分离出的抗菌肽LS2在绿藻中表达后对蛋白酶具有完全耐受性。未来可以通过生物工程和纳米颗粒的包裹来提高IMAU80122所产抑菌物质对胃肠道消化蛋白酶的稳定性，从而用于治疗人类和动物感染[14]。

表2 植物乳杆菌IMAU80122所产抑菌物质的酶稳定性Table 2 Enzymatic stability of bacteriostatic substance produced by L.plantarum IMAU80122

2.2.4 表面活性剂对抑菌物质活性的影响

化学稳定性支持了抑菌物质的研究与应用。如图3所示，IMAU80122所产抑菌物质对尿素相对稳定，表现出>90%的剩余抑制活性，但经SDS、Triton X-100、吐温-20处理后，抑菌能力出现了大幅度的下降，剩余活性降低到73.17%、72.91%、80.27%。相反，EDTA和吐温-80对抑菌物质的抑菌活性有促进作用。据文献报道，在一定条件下，表面活性剂增强蛋白类的抑菌作用是通过影响蛋白质的三维构象来使蛋白质展开，从而提高各种蛋白质的溶解度，增强蛋白的活性[15]。

图3 表面活性剂对植物乳杆菌IMAU80122所产抑菌物质抑菌活性的影响Fig.3 Effect of surfactants on antibacterial activity of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122

2.2.5 金属离子对抑菌物质活性的影响

如图4所示，和未经金属盐处理的上清液相比，Ca2+的加入对抑菌物质的抑菌能力造成损失，添加Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+使抗菌肽活力增强。YAO等[16]发现从海鞘中分离出的纤溶蛋白对金属离子具有稳定性，并且Mn2+、Mg2+、Ca2+和Na+可以增强其抑菌效果。抑菌物质对金属离子的稳定性或各种金属离子对抑菌活性的促进作用，原因可能是金属离子诱导了蛋白质结构的构象变化，同时，一些金属离子可以起到辅助因子的作用，使蛋白质以可溶的形式稳定[17]。

图4 金属离子对植物乳杆菌IMAU80122所产抑菌物质抑菌活性的影响Fig.4 Effect of metal ions on antibacterial activity of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122

图5 有机溶剂对植物乳杆菌IMAU80122所产抑菌物质抑菌活性的影响Fig.5 Effect of organic solvents on antibacterial activity of antibacterial substances produced by L.plantarum IMAU80122

2.2.6 有机溶剂对抑菌物质活性的影响

IMAU80122所产的抑菌物质被不同的有机溶剂处理后抑菌活性相对稳定(P>0.05)，其中乙醇和三氯甲烷对抑菌物质的活性造成了损失，但所有处理组剩余活性均在90%以上。抑菌活性的丧失可能是由于抑菌物质被有机溶剂降解，迫使蛋白质的三维结构展开，通常会导致功能被破坏，甚至蛋白质被分解[18]。

2.2.7 盐浓度对抑菌物质活性的影响

如图6所示，4%以下的NaCl浓度不会对IMAU80122所产抑菌物质的活性造成影响，当NaCl浓度高于4%时，抑菌活性开始随着NaCl浓度的增高而明显降低(P<0.05)。BAGDE等[19]从屎肠球菌中纯化的细菌素在1%的盐浓度中活性不会受到影响。在ZHANG等[20]的研究中，从植物乳杆菌J23中纯化出的细菌素Lac-B23在盐浓度由低到高的环境中，抑菌活性出现了先下降后上升的变化，但并不显著。这与本研究的结果不尽相同，可能与抑菌物质自身的结构有关。

图6 不同盐浓度对植物乳杆菌IMAU80122所产抑菌物质抑菌活性的影响Fig.6 Effects of different salt concentrations on the antibacterial activity of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122

2.2.8 紫外照射对抑菌物质活性的影响

如图7所示，该抑菌物质在紫外照射40和60 min时活性降低较明显，紫外线照射对抑菌物质活性的影响随着时间的延长而逐渐加深。冉军舰等[21]从嗜酸乳杆菌中提纯的抗菌肽在紫外线照射30 min后抑菌效果无明显变化，仅在紫外线照射1 h后抑菌圈显著减小。舒梨等[22]对副干酪乳杆菌产生的抗菌肽研究中也发现了同样的规律，与本实验的结果一致。

图7 紫外照射对植物乳杆菌IMAU80122所产抑菌物质抑菌活性的影响Fig.7 Effects of ultraviolet irradiation on antibacterial activity of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122

2.3 抑菌物质的抑菌谱

由表3可知，植物乳杆菌IMAU80122对革兰氏阳性(G+)菌和革兰氏阴性(G-)菌均有抑菌效果，其中对G-菌，如大肠埃希氏菌、肠沙门氏菌、副溶血弧菌有非常强的抑菌活性。

表3 植物乳杆菌IMAU80122所产抑菌物质的抑菌谱Table 3 Bacteriostatic spectrum of bacteriostatic substance produced by L.plantarum IMAU80122

对荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、福氏志贺菌和阪崎肠杆菌稍弱(图8-a～图8-g)；对G+菌，如金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、产气荚膜梭菌、蜡状芽孢杆菌有一定的抑制作用(图8-h～图8-k)；对真菌的抑制作用较差，其中仅对芽枝状枝孢表现出较弱的抑菌作用，对串珠镰刀菌、黑曲霉和酿酒酵母无抑菌活性。从整体来看，相比G+菌，G-菌对IMAU80122所产抑菌物质更为敏感；同时，该抑菌物质对供试的乳酸菌均无抑菌活性，包括与其亲缘性近的种属，这与国内外对乳酸菌所产蛋白类抑菌物质的抑菌谱报道相一致[23]，同其他文献相比，IMAU80122所产抑菌物质在抑制食源性致病菌的方面具有很大优势，说明该抑菌物质有潜力作为食品防腐剂添加在食品中，对控制食品安全也具有重要的意义。

a-肠沙门氏菌；b-大肠埃希氏菌；c-铜绿假单胞菌；d-副溶血性弧菌；e-阪崎克罗诺杆菌；f-福氏志贺氏菌；g-荧光假单胞菌；h-蜡状芽孢杆菌；i-产气荚膜梭菌；j-单增李斯特氏菌；k-金黄葡萄球菌图8 植物乳杆菌IMAU80122所产抑菌物质对不同指示菌的抑菌圈Fig.8 Bacteriostatic zone of L.plantarum IMAU80122 on different indicator bacteria注：图中孔直径均为8 mm，孔周深色部分为样品对指示菌的抑菌区域

3 结论

本研究利用牛津杯双层琼脂打孔法从114株分离自四川泡菜的植物乳杆菌中，筛选出16株产蛋白类抑菌物质的菌株。进一步对3株菌IMAU80122、IMAU80028和IMAU80043的酸碱稳定性和热稳定性进行比较，得到一株抑菌活性强且抑菌特性良好的植物乳杆菌——IMAU80122。实验结果表明，IMAU80122所产抑菌物质对G+菌株和G-菌株均具有抑制效果，其中对G-菌的抑制效果更好，但对供试的乳酸菌均没有抑菌活性；并且植物乳杆菌IMAU80122所产抑菌物质具有耐酸、耐碱的特性，具有一定的热稳定性，对不同的表面活性剂、有机溶剂、金属离子、紫外照射和盐浓度均具有良好的耐受性，这些特性将有助于其进一步的分离纯化，同时也有利于其作为食品、医药添加剂的商业化应用。