酶解与发酵技术在水产饲料蛋白原料高值化利用中的应用研究进展

■王彦波 张宇婷 李道君 栾银银 李毛毛 张 震 周志刚

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018；2.中国农业科学院饲料研究所，中国-挪威鱼类消化道微生物联合实验室，北京100081；3.中国农业科学院饲料研究所，农业农村部饲料生物技术重点开放实验室，北京 100081）

我国是世界上水产养殖规模最大的国家，2020年我国水产品总产量6 549.02 万吨。其中，养殖产量5 224.20万吨，同比增长2.86%，捕捞产量1 324.82万吨，同比降低5.46%，养殖量与捕捞量比例为79.8∶20.2[1]。随着水产养殖规模上升，水产饲料的需求大幅增大，尤其使得饲料蛋白原料资源日趋紧张[2]。蛋白原料主要分为动物源性蛋白原料、植物源性蛋白原料和单细胞蛋白饲料等。鱼粉是水产饲料中常用的优质蛋白源，但由于资源有限、价格居高不下，因此植物源或其他低成本蛋白原料在水产饲料中广泛使用。与此同时，水产动物对这些蛋白原料利用效率上还存在短板，主要原因是实际的饲料加工中并未将蛋白原料的部分缺点充分克服（包括含抗营养因子、适口性差以及消化吸收率低等），未将利用潜能充分释放，导致蛋白原料的浪费。因此，充分提高现有蛋白原料和改善低成本新蛋白原料的利用效率，实现水产饲料原料的高值化利用，已成为水产饲料业亟待解决的共性问题。

研究发现，蛋白原料的生物酶解技术和微生物发酵技术是蛋白原料提质增效的关键技术。与传统饲料相比，酶解及发酵饲料具有独特的优势。对于酶解，饲料蛋白原料经酶解后含有更易利用的小肽与丰富的酸类等生物活性因子，不仅能使营养成分更丰富，还可改善动物肠道菌群结构及机体的免疫性能，达到提高原料的吸收利用率和饲用价值的效果[3]；对于发酵，通过微生物的代谢作用可以降解原料中的蛋白质、多糖、脂肪等成分，产生可溶性寡肽、寡糖、有机酸等小分子物质。微生物在发酵过程中还能够产生一些维生素、细菌素等未知因子，同时也能够有效降解饲料中的一些抗营养因子，如单宁、棉酚、凝集素等，提高了饲料原料的营养价值，饲料发酵后能形成一种独特的香味，可促进水产动物摄食，增加免疫能力[4]。

对于水产上应用酶解及发酵饲料蛋白原料的功能研究，目前已有大量报道，包括抗生素替代、提高消化率、减少抗营养因子等多种优点，但尚未构成体系。因此，针对这一关注热点，文章总结和归纳了饲料蛋白原料的生物酶解技术与微生物发酵技术，阐述了其在水产饲料原料高值化利用中的研究和应用现状，并展望了未来可能的发展趋势，为酶解和发酵生物饲料更好地支撑水产绿色养殖提供依据。

1 酶解技术在水产饲料蛋白原料高值化利用中的应用

酶解饲料蛋白原料是利用外源酶对蛋白原料等进行有效的降解，处理后主要为饲料蛋白原料的降解产物。通常是对高蛋白含量的植物蛋白原料、动物蛋白原料等进行处理。酶解蛋白原料是改造蛋白质、实现蛋白质功能多元化、提高蛋白质附加值的最有效途径之一。同时由于水产动物的消化系统一般没有畜禽的完善，内源消化酶分泌不完全，限制了水产动物对饲料中营养成分的消化吸收。而如果预先使用蛋白酶处理饲料蛋白原料，可以使大分子蛋白降解为小肽以及氨基酸，减少了对消化道的应激并增加了对营养物质的吸收，提高了饲料蛋白的利用效率。

1.1 酶的种类

饲料工业上常用的蛋白酶见表1，主要包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶及胃蛋白酶等，这些酶及其制剂产品来源于动物、植物或微生物，它们可以单一使用或复合使用[5-6]。

表1 常用的酶解蛋白原料的蛋白酶

1.1.1 碱性、酸性蛋白酶和中性蛋白酶

多数水产动物没有胃，只存在消化道，无胃鱼的消化道内一般pH是中性或偏碱性的，因此在无胃鱼的饲料中使用外源蛋白酶时，需选择适宜中性或偏碱性的蛋白酶。而有胃鱼由于存在胃酸的分泌，消化道内pH较低，应选择使用酸性蛋白酶。碱性蛋白酶广泛存在于植物茎叶果实、动物内脏以及微生物中。饲料中添加碱性蛋白酶对水产动物养殖具有积极的应用效果。Mamauag等[7]使用碱性蛋白酶对作为动物蛋白原料的遮目鱼内脏进行酶解，并进一步通过养殖实验表明，与饲料中使用遮目鱼内脏相比，饲料中使用遮目鱼内脏水解物组的石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）的饲料转化率、采食量和增重显著提高。酸性蛋白酶的最适pH在2左右，中性蛋白酶的最适pH在7.0～8.0，中性蛋白酶与酸性蛋白酶是在饲料工业中应用较多的蛋白酶。中性蛋白酶与酸性蛋白酶均具有提高饲料营养物质利用率和鱼体生长性能等功能[8-9]。

1.1.2 木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶一般是用木瓜加工提取获得，存在于番木瓜的根、茎、叶以及果实中，其中含量最高的部位是未成熟的果实，获得的木瓜蛋白酶类是一种粗酶提取物，并不是纯酶，不仅含有木瓜蛋白酶，还含有溶菌酶、纤维素酶、葡聚糖酶等。Mo等[10]研究表明，与鱼粉组相比，木瓜蛋白酶处理的豆粕组显著提高了平鲷（Rhabdosargus sarba）、橙 点 石 斑 鱼（Epinephelus bleekeri）、卵形鲳鲹（Trachinotus blochii）3 种海水鱼的增重率，降低了饲料系数，并且可以改善使用动物类蛋白源鱼粉引起的水质污染。

1.1.3 菠萝蛋白酶

菠萝蛋白酶主要存在于菠萝的果、茎、叶以及皮中，提取利用的主要是果酶和茎酶。获得的菠萝蛋白酶均是混合蛋白酶，果肉中的菠萝蛋白酶，主要包括果菠萝蛋白酶A（fruit bromelain A）和果菠萝蛋白酶B（fruit bromelain B），而从茎中提取的菠萝蛋白酶含有9 种组分（F1～F9），其中组分F4 和F5 是主要的成分，而组分F9的酶活最强[11]。Choi等[12]研究表明，与商品鱼饲料相比，使用包含菠萝蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合酶处理食物残渣后作为饲料投喂草鱼，显著提高了草鱼的生长性能和免疫性能。

1.1.4 胃蛋白酶和胰蛋白酶

胃蛋白酶是胃液中最重要的消化酶。胃蛋白酶是来源于动物胃中作用最强的消化酶，以无活性的酶原颗粒的形式贮存在细胞内，在蛋白激酶等的作用下转变为有活性的胃蛋白酶。作为一种肽链内切酶，胃蛋白酶作用于酸性氨基酸和芳香族氨基酸所形成的肽链，从而分解蛋白质，因此该酶可广泛应用于饲料原料的酶解[6]。胰蛋白酶是一种肽链内切酶，属于丝氨酸蛋白酶家族，对由碱性氨基酸（如精氨酸和赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。亦可以催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键[6]。另外，鱼类肝胰脏蛋白酶最适pH为7.0～9.0，在中性和弱碱性范围[13]。

1.1.5 风味蛋白酶

风味蛋白酶由米曲霉发酵产生，同时具备内切酶和外切酶活性，是一种广泛运用的商业酶[14]。Ma等[15]研究表明，风味蛋白酶可以显著降低碱性蛋白酶酶解后大豆水解蛋白的苦味，并进一步显著提高其水解度。Zheng 等[16]研究表明，用酶法生产（碱性酶和风味酶）处理的鱼蛋白小分子量化合物水解液对日本牙鲆幼鱼的生长和饲料转化率均有显著的促进作用。鱼类膳食蛋白质水解液可改善血浆胰岛素样生长因子-I（IGF-I）水平，改善肝脏牙鲆IGF-I mRNA的表达[16]。

1.1.6 淀粉酶、非淀粉多糖酶和植酸酶

植物蛋白原料中除蛋白质外，还存在淀粉、非淀粉多糖以及抗营养因子等。淀粉酶是可以分解淀粉中的各种糖苷键、对淀粉有专门水解作用的一类酶的总称[17]。目前，单一淀粉酶在畜禽动物上的应用较多，但在水产动物上研究较少，大多是作为复合酶制剂的一种酶成分添加到饲料中使用[18]。非淀粉多糖（NSP）是植物源饲料原料中的多聚体，包括纤维素、半纤维素、果胶等，抗营养作用较强，并且可以提高消化道中食糜的黏度，从而降低动物对饲料养分的消化利用率。非淀粉多糖酶主要包括纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和β-葡聚糖酶等，可以降解饲料中NSP，降低其抗营养作用，从而提高饲料利用率[19]。植酸酶又称为肌醇六磷酸水解酶，可催化肌醇六磷酸（盐或酯）脱掉磷酸基团，自然界中产植酸酶的微生物种类繁多。饲用植酸酶主要通过微生物发酵获得，可以催化降解植酸及其盐类变为肌醇和无机磷，从而提高动物体对饲料中磷的利用，减少磷的排泄量，减少环境污染[20]。

1.2 酶解技术

1.2.1 单一酶解技术

单一酶解是最基础的酶解技术，即使用单一蛋白酶对蛋白原料中的蛋白质进行降解。单一酶解只能对饲料蛋白原料进行简单地水解，得到小肽，有利于动物对蛋白质的吸收。单一酶解中一般常用酶包括木瓜蛋白酶类、菠萝蛋白酶类以及胃-胰蛋白酶类。同一种原料使用不同的蛋白酶进行酶解得到的产物也各不相同[21]。

1.2.2 复合酶解技术

与单一酶相比，复合酶包含多种具有不同识别序列和酶切位点的蛋白酶，多种蛋白酶能够协同发挥作用，高效催化水解饲料蛋白原料中大分子蛋白质。Beal 等[22]在20 世纪就开展了利用复合酶进行豆粕和生大豆的酶解研究，发现酶解产物中分子量大于66 ku的蛋白质分子的含量和比例都有所减少，显示复合酶解技术能够使部分高分子蛋白质降解为较小的蛋白质片段。李泽涛[8]以菜籽粕、豆粕为原料，确定了中性蛋白酶单酶酶解的最适条件，进一步研究发现复合酶（中性蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶）分步酶解获得的小肽含量显著高于单一蛋白酶（中性蛋白酶）作用。

1.3 应用效果

动物源性饲料蛋白原料酶解的研究大部分关注不同来源蛋白的水解。Houssem等[23]使用碱性蛋白酶和风味蛋白酶处理生产金枪鱼头水解物，采用统计建模和双目标优化来优化操作参数，产生了理想分子量分布的鱼蛋白水解物。Fonseca等[24]用不同的酶（碱性蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶）水解军曹鱼肉和废弃物，发现复合蛋白酶的水解肉类中游离酪氨酸含量最高，为6.47%，碱性蛋白酶和复合蛋白酶的水解废弃物中游离酪氨酸含量最高，分别为8.46%和6.46%。金菲[25]以猪血球蛋白为原料，分别选用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合风味蛋白酶对猪血球蛋白进行单一酶解，以水解度和可溶性蛋白含量为评价指标，发现中性蛋白酶和复合风味蛋白酶的酶解效果优于木瓜蛋白酶；进一步以最佳酶解条件获得酶解血球蛋白粉制作饲料投喂鲫鱼，结果表明酶解可以有效提高鲫鱼对血球蛋白粉的利用率。徐歆歆[26]利用等比例复合酶（碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶）制备酶解蚕蛹粉，用酶解蚕蛹粉分别替代框鳞镜鲤饲料中的鱼粉。结果表明，酶解蚕蛹粉在框鳞镜鲤饲料中对鱼粉的替代水平少于50%时不会影响鱼体生长及健康状况。

植物源性饲料蛋白原料酶解后产生的活性肽类，不仅有营养作用，促进动物生长，而且能提高机体免疫力，增强抗病力。刘文斌[27]用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶酶解豆粕、棉粕、菜粕和花生粕，以基础日粮为对照，将4 种饼粕酶解产物饲喂异育银鲫，喂养61 d后发现各组异育银鲫增重率均有提高，饲料系数下降，其中添加棉粕酶解物组增重率最高，提高32.13%；棉粕枯草蛋白酶酶解产物小肽数量和生物效价较高，进一步养殖实验发现添加1.5%和3.0%的酶解产物的增重率分别提高33.19%和69.62%。夏薇等[28]以2%的酶解棉粕（使用枯草芽孢杆菌中性蛋白酶进行酶解）分别等质量替代饲料中鱼粉或植物蛋白原料，投喂建鲤。结果表明，替代鱼粉组或植物蛋白组建鲤的增重率和特定生长率均显著高于相应的对照组，而且酶解棉粕可提高建鲤血清溶菌酶、碱性磷酸酶以及肠道内蛋白酶的活性。王凯周[29]研究发现，酶解棉粕替代10%鱼粉能够促进中华鳖稚鳖肠道绒毛发育及免疫基因表达，并提高肠道消化吸收酶活性。

2 发酵技术在水产饲料原料高值化利用中的应用

2.1 菌的种类

自然界中微生物资源十分丰富，微生物菌种在饲料发酵过程中起着关键性作用。根据农业农村部2045 号公告及后续修订公告汇总，截至2021 年9 月，饲料添加剂目录中允许作为饲料添加剂的微生物菌种达到36种[30]。

2.1.1 乳杆菌

乳杆菌（Lactobacillus）是一类能发酵碳水化合物且产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌，常用作益生菌添加剂。Ximenes 等[31]利用乳杆菌（Lactobacillus futsaiiLAB06 和L.plantarumLAB14）发酵虾头废弃物48 h得到发酵产物。进一步发现虾头废弃物的发酵物替代饲料中30%鱼粉可以显著提高尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的生长性能，表明了虾头废弃物的发酵物可作为饲料蛋白原料，具有一定的经济效益，且有助于减少虾类废弃物处置不当造成的环境污染。

2.1.2 芽孢杆菌

芽孢杆菌（Bacillus）是一种能产生芽孢的革兰氏阳性细菌，是一类在水产动物中应用普遍的益生菌。目前在发酵饲料研究中应用较多的有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）等。Wang等[32]用枯草芽孢杆菌LCBS1发酵豆粕替代鱼粉饲喂牛蛙，发现添加LCBS1菌可改善牛蛙的生长和消化，减轻豆粕饲料引起的肠道结构损伤和菌群失调。Shiu 等[33]研究了枯草芽孢杆菌E20发酵豆粕（FSBM）部分替代斜带石斑鱼饲料中鱼粉的潜力，以鱼粉为基础对照组饲料，分别用10%、20%和30%豆粕替代鱼粉，以及10%、20%、30%和40% FSBM 替代鱼粉的7 种饲料饲喂84 d。结果发现，20%豆粕替代鱼粉时，石斑鱼的生长性能和饲料效率显著降低，而当FSBM 替代鱼粉达30%时，石斑鱼的生长性能和饲料效率与对照组无显著差异，进一步发现以饲料效率为依据，石斑鱼饲料中豆粕和发酵豆粕对鱼粉的最大替代量分别为18.36%和29.32%，这表明发酵后的豆粕饲用价值显著提升。

2.1.3 酵母菌

酵母（Yeast）是一类结构简单的真菌，广泛应用于食品和饲料工业。酵母生长繁殖快、营养价值高，菌体或其提取的甘露糖蛋白具有显著非特异性免疫调节和营养功能。Dileep 等[34]以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）固体发酵瓜尔豆和干椰子粉的混合原料，发现通过发酵显著提高了原料中蛋白质和氨基酸的含量，降低了抗营养因子水平。进一步通过罗非鱼（Oreochromis niloticus）养殖实验发现，使用发酵产物替代饲料中17.45%的鱼粉时罗非鱼生长性能显著提高，但替代比例超过25%时则会抑制罗非鱼生长。

2.1.4 霉菌

霉菌发酵主要可以降解植物原料中纤维素等成分，从而作为潜在的发酵剂应用到发酵饲料中。杜健[35]在纤维素酶系组成、纤维素酶辅助因子和单酶组分性质等方面研究了草酸青霉分泌的纤维素酶，并针对性提出提高其降解纤维素能力的策略。半纤维素是影响纤维素酶对纤维素的可及性与降解效率的重要因素。杨毅[36]的研究中发现产黄青霉P33（Penicillium chrysogenumP33）能够分泌完整且高丰度的半纤维素降解酶类。进一步发现，与商业纤维素酶相比，使用P33胞外酶系替换50%商业纤维素酶后，显著促进对脱木质素玉米秸秆的水解，使还原糖的释放量增加78.6%，葡聚糖和木聚糖的转化率分别增加了37%和106%。

2.2 发酵技术

微生物发酵饲料蛋白原料的一般生产工艺为：原料→消毒→冷却→接种→培养→干燥→包装，其核心技术是原料的固态发酵。固态发酵是一种在缺乏或几乎没有游离水的固体基质进行的发酵方式，但是需要底物（固体基质）中含有一定的水分用于微生物生长与代谢，在整个发酵过程中应严格控制空气流通和发酵热量的释放[4，37]。相比液态发酵，固态发酵技术有着能耗低、成本低、环境友好、产生废水少等优势。微生物固态发酵饲料在提高原料营养物质利用率和降低抗营养因子等方面展现出良好结果。陈龙[37]研究发现，与利用贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）157 单一固态发酵玉米秸秆相比，Bacillus velezensis157固态发酵玉米秸秆和豆粕的混合物，产生的纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶含量显著上升，纤维降解效率提高。Shi等[38]利用黑曲霉、假丝酵母和枯草芽孢杆菌固态发酵辣木叶粉，结果显示发酵后辣木叶粉粗蛋白、小肽和氨基酸的浓度显著增加，粗脂肪、粗纤维、总糖及单宁、植酸和芥子油苷等抗营养因子含量显著下降。

2.3 应用效果

微生物发酵饲料的使用是促进水产养殖向绿色健康养殖转型的重要途径之一。微生物发酵饲料在提高营养物质的利用率，提高水产动物生长性能基础上，发酵饲料中含有的大量有益微生物及有益因子，能够在鱼虾肠道内与有害菌形成定植竞争，抑制有害菌的生长，也能够改善鱼虾肠道环境，增强肠道菌群稳定性，保护肠道黏膜，改善机体免疫机能等。由表2 可见，应用微生物发酵豆粕、棉粕等饲料蛋白原料能够消除原料自身限制使用因素，当按一定比例替代鱼粉或豆粕时能够不影响或改善水产动物生长性能，明显降低使用未发酵原料时造成的负面效应。综合以上研究发现，替代蛋白源经过微生物发酵技术，饲用品质明显提升，在饲料中替代比例可以显著提高。

表2 发酵饲料原料替代鱼粉的研究和应用效果

3 前景与展望

由于优质饲料蛋白原料资源的严重紧缺，加速推动了水产饲料中植物源或其他低成本蛋白原料等替代蛋白源的开发，但是由于大多替代蛋白源的固有局限性（包括难以消化吸收、适口性差以及含抗营养因子等），一般不能被水产动物高效利用。因此采用生物酶解或发酵技术对饲料蛋白原料进行处理，克服其应用限制，提高其利用效率，是实现其高值化的重要途径，有利于推进水产养殖的绿色可持续发展。

生物酶解技术和微生物发酵技术均是提高饲料蛋白原料利用效率的关键技术，酶解技术对大分子蛋白质降解为易于利用小分子物质的专一性更强、效率更高；而微生物发酵技术不仅可以将饲料中的大分子蛋白质、多糖等成分降解为易于利用的小分子物质，也可以有效降解饲料中的抗营养因子，并能产生维生素、细菌素等未知有益因子。但目前酶解技术也存在处理原料单一、生产成本较高以及产品性能欠佳等问题，使其应用推广受到很大的制约。因此，为充分利用两种技术的优势，菌酶协同发酵技术成为行业新的关注点和发展趋势。菌酶协同发酵是在发酵原料中添加一定量的酶制剂来协同微生物发酵，结合酶解法和微生物发酵法的优点，在提高原料营养物质利用率、降解原料中的抗营养因子、调节饲料苦味、改善饲料适口性的基础上，进一步解决单一微生物发酵产酶不足或酶解法口味不佳等问题。同时能够缩短发酵周期，改善动物肠道菌群结构，增强动物免疫力，减少抗生素的使用[46]。赵小惠等[47]研究发现，金枪鱼暗色肉（金枪鱼加工后下脚料）经枯草芽孢杆菌和中性蛋白酶协同发酵后，可将大分子蛋白质有效降解，发酵体系内小肽含量由28.89 mg/g 上升到185.59 mg/g，提高其营养价值。Wang 等[48]研究发现使用芽孢杆菌和嗜热菌蛋白酶共同处理豆粕后，大豆蛋白降解为多种小肽。岳丽等[49]以产朊假丝酵母与黑曲霉为发酵菌株，协同木聚糖酶与纤维素酶发酵高粱秸秆，结果表明在优化工艺基础上，菌酶协同发酵可以显著提高甜高粱秸秆的饲用品质，发酵产物粗蛋白含量达15.51%。

目前菌酶协同发酵相关的研究仍在初始阶段，还需要继续深入研究[3，50-51]。①在发酵菌株的开发上，存在发酵菌株性能不稳定、耐受性低等问题，另外由于水产动物肠道菌群结构显著区别于畜禽的特点，需要开发针对水产动物的高效土著菌株资源；②菌酶协同机理上还缺乏深入研究，包括菌株之间、不同酶之间、菌与酶之间以及协同发酵产物与水产动物间的相互作用；③菌酶协同发酵相比单酶解或单发酵技术优势明显，但目前集中在饲料蛋白原料的处理上，针对成分复杂的饲料原料或混合原料的发酵过程缺乏深入的研究，同时缺乏稳定的效果评价和完善的应用方案标准。此外，发酵全价料已经开始应用于饲料工业，同时由于潜在的明显优势，菌酶协同发酵水产全价饲料同样引起行业的极大关注，但目前还鲜有相关研究的报道，是未来一个重要的关注点。随着对水产动物饲料的酶解和发酵技术研究的不断深入，会推进这些问题的解决。在当前推进绿色可持续养殖的背景下，基于酶解与发酵技术的生物饲料必然会成为饲料行业的重要发展方向和新的增长点，推动水产养殖业的健康可持续发展。