日粮添加过瘤胃亮氨酸对泌乳奶山羊氨基酸代谢和免疫性能的影响

■陈 捷 王砀砀 武彦博 王燕南 陈 超 雷新建 李延华 姚军虎*

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西澳尼克奶山羊育种有限公司，陕西 富平 711700）

随着我国畜牧业的发展，传统营养手段已无法完全满足高产动物的营养需要，精准营养为解决此瓶颈提供了新的方案。氨基酸在提高反刍动物生产力和饲料效率、维持机体健康等方面发挥重要作用[1]。氨基酸不仅是蛋白质合成的前体物，还是体内重要的生物活性物质[2]。作为功能性氨基酸，亮氨酸除作为蛋白质底物外，还可通过雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路调控动物机体蛋白合成及分解代谢，如亮氨酸可促进绵羊骨骼肌mTOR信号通路中4E-BP1和p70S6K的磷酸化，进而促进骨骼肌蛋白合成[3]；亮氨酸通过激活调控蛋白质合成最主要的信号通路PI3K/Akt-mTOR轴，并抑制蛋白质降解最主要的信号通路GCN2，提高奶牛胰腺腺泡细胞消化酶的合成，促进小肠淀粉的消化利用，改善饲料报酬[4-5]。

氨基酸代谢包括合成和分解代谢，饲料消化吸收的氨基酸、机体组织蛋白质动员产生的氨基酸及体内合成的非必需氨基酸均进入血液，构成机体氨基酸代谢库，参与氨基酸的代谢。除作为信号分子调控机体蛋白质合成代谢外，亮氨酸也参与动物氨基酸代谢的调控[6-7]。乳蛋白的合成也需要氨基酸的参与[8]，然而，亮氨酸如何参与调控奶畜在泌乳期氨基酸代谢仍不清楚。一些研究也表明，支链氨基酸参与机体免疫调节[9]。因此，本研究在泌乳奶山羊饲粮中补充过瘤胃亮氨酸，并将赖氨酸（一般限制性氨基酸）作为对照，探究功能性氨基酸对泌乳奶山羊氨基酸代谢和免疫性能的影响，为功能性氨基酸在奶山羊生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

过瘤胃亮氨酸（rumen-protected leucine，RPLeu），初始含量70.7%，瘤胃液12 h 保留率85.4%，肠液12 h溶出度77.9%。过瘤胃赖氨酸（rumen-protected lysine，RP-Lys），初始含量60.9%，瘤胃液12 h保留率85.7%，肠液12 h 溶出度79.9%。产品购自杭州康德权饲料有限公司。

1.2 试验动物及饲粮

试验选用泌乳关中奶山羊，参照美国NRC（1985）奶山羊的营养需要与试验场实际情况配制全混合日粮（total mixed ration，TMR），基础饲粮组成及营养水平见表1，基础饲粮氨基酸水平见表2。

表2 基础饲粮中主要氨基酸组成

1.3 试验设计与饲养管理

动物饲养试验在陕西澳尼克奶山羊育种有限公司进行，试验流程及操作完全遵守西北农林科技大学动物保护委员会规章。本试验共选取45只初产关中泌乳奶山羊，泌乳期为（135±15）d，泌乳量为（2.06±0.45）kg/d，体重为（43.11±5.38）kg，随机分为3组：对照组（CON 组，采食基础饲粮）、过瘤胃亮氨酸添加组（LEU 组，基础饲粮+10.6 g/d RP-Leu）及过瘤胃赖氨酸添加组（LYS 组，基础饲粮+12.0 g/d RP-Lys），每组15 只。本试验氨基酸添加量参考Yu 等[10]研究成果（亮氨酸和赖氨酸小肠实际溶出量为5 g/d），根据产品氨基酸含量、过瘤胃率和小肠溶出率将过瘤胃亮氨酸和赖氨酸添加量定为10.6 g/d 和12.0 g/d。试验期为60 d，前15 d 为预试期，后45 d 为正试期。TMR 等量饲喂，日饲喂3次（06：30、13：00、19：30）。两个处理组氨基酸均匀加入TMR中，日挤奶2次（04：30、16：30），全天自由饮水。

1.4 样品收集

每个处理随机抽取10只羊进行样品采集。于正试期第44天、第45天晨饲前1 h进行颈静脉分批次采血，采集后置于冰盒中迅速送回实验室，静置30 min后3 500 r/min 离心15 min，取上清液分装于2 mL 冻存管中，置于-80 ℃冰箱保存待测。于正试期第45天采集乳样（每天挤奶2 次，按实际产奶量比例混合成全天样）。乳样品采集后置于-80 ℃冰箱保存待测。

1.5 血清游离氨基酸测定

使用Exion LC AC 高效液相色谱仪（AB SCIEX）串联QTRAP 5500 质谱仪（AB SCIEX）分析测定血清游离氨基酸含量。采用4.6 mm×100 mm×2.7 μm InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色谱柱（Agilent）。质谱仪装配有电喷雾（electrospray ionization，ESI）作为离子源，为ESI+一种离子模式。主要参数为：气帘气：40 psi；碰撞气压力：Medium；离子喷雾电压：5 500 V；温度：650 ℃；离子源雾化气1∶60 psi；离子源雾化气2∶60 psi。

血清游离氨基酸前处理方法：取100 μL 血清样品，加入300 μL 乙腈，涡旋15 s 后，13 000 r/min 离心5 min，取上清液通过0.22 μm过滤器过滤后上机分析。

1.6 乳蛋白和乳水解氨基酸测定

乳蛋白使用Combi 500 乳成分分析仪（Bentley）测定。使用Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent）对乳水解氨基酸进行分析，采用Eclipse AAA 4.6×150 mm 5-Micron色谱柱（Agilent），检测器采用DAD二极管检测器。水解氨基酸前处理采用酸水解法，具体操作步骤如下：

准确称取冻干乳样50～200 mg，小心加入水解管中，注意尽量防止挂壁。小心加入1∶1的分析纯盐酸（约6 mol/L）10 mL。使用氮吹仪吹氮气15 min 后封管，置烘箱中于110 ℃水解22～24 h。水解后的样品取出冷却至室温，开管后用小漏斗和滤纸过滤到50 mL小容量瓶中，水解管用去离子水洗涤3 次，洗涤液过滤到容量瓶中，用去离子水洗涤滤纸，洗涤液也收集到小容量瓶中，定容至刻度线。吸取定容后的样品1 mL，置RVC2-18 CDplus真空旋转蒸发仪（Christ）上脱酸。温度60 ℃，脱至干燥，底部留有少许固体或痕渍为止。脱酸后的样品，加入1 mL 样品柠檬酸钠缓冲液，置振荡混合器上混合均匀，针管吸取少量，通过0.22 μm过滤器过滤后上机分析。

1.7 血液免疫指标测定

谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总蛋白、白蛋白和球蛋白采用Hitachi 7600 全自动生化分析仪（Hitachi Group）检测，血清免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA；Goat IgA ELISA Kit, F3869-A）使用上海泛柯实业有限公司生产的酶联免疫反应试剂盒测定，血清白细胞介素6（interleukin 6，IL-6；Goat IL-6 ELISA Kit,JL22321）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β；Goat IL-1βELISA Kit, JL17446)、干扰素γ（interferonγ，IFN-γ；Goat IFN-γELISA Kit, JL13108）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α；Goat TNF-αELISA Kit, JL11962）使用上海江莱生物科技有限公司生产的酶联免疫反应试剂盒测定,主要涉及仪器是Synergy HT多功能酶标仪（BioTek）。

1.8 数据处理

统计分析采用SPSS 23.0（SPSS, Inc., Chicago, IL,USA）单因素方差分析，组间采用LSD 法做多重比较。P＜0.05 代表差异显著，0.05≤P＜0.10 代表存在显著性趋势，数据以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 日粮添加RP-Leu 和RP-Lys 对泌乳奶山羊静脉血清游离氨基酸浓度的影响（见表3）

由表3 可知，Gln、Leu、Ile 和Ala 是奶山羊血清中含量较高的氨基酸。与CON组相比，LEU组显著提高了血清中BCAA、Ile 和Thr 的浓度，降低了Pro 的浓度（P＜0.05），有提高Leu、Trp、TAA 和EAA 浓度的趋势（0.05≤P＜0.10）。与LYS 组相比，LEU 组显著提高了血清中BCAA、Ile 和Thr 的浓度，降低了Pro 的浓度（P＜0.05）。CON 组与LYS 组两组间血清游离氨基酸含量无显著差异（P＞0.05）。

表3 亮氨酸和赖氨酸对泌乳奶山羊血清游离氨基酸浓度的影响（μmol/L）

2.2 日粮添加RP-Leu 和RP-Lys 对泌乳奶山羊乳蛋白和氨基酸组成的影响（见图1、表4）

由图1 可知，日粮添加RP-Leu 和RP-Lys 对泌乳奶山羊产奶量以及乳蛋白合成量无影响（P＞0.05）。由表4可知，Pro、Glu、Leu和Asp是乳蛋白中含量较高的氨基酸，3组间氨基酸含量无显著差异（P＞0.05）。

表4 亮氨酸和赖氨酸对泌乳奶山羊乳水解氨基酸浓度的影响（mmol/L）

图1 亮氨酸和赖氨酸对泌乳奶山羊产奶量以及乳蛋白合成的影响

2.3 日粮添加RP-Leu 和RP-Lys 对泌乳奶山羊免疫性能的影响（见表5）

由表5可知，两种氨基酸对泌乳奶山羊血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总蛋白、白蛋白、球蛋白、IgA、IL-6、IL-1β、IFN-γ和TNF-α无显著性影响（P＞0.05）。

表5 亮氨酸和赖氨酸对泌乳奶山羊免疫性能的影响

3 讨论

动物机体蛋白质是一个动态平衡体系，细胞不断地将氨基酸合成蛋白质，又将蛋白质降解成氨基酸[11]。蛋白质降解的氨基酸通过血液进入氨基酸代谢库，一部分又重新合成蛋白质，从而实现组织蛋白质的更新与演替[12]；另一部分氨基酸通过转氨基、脱氨基或脱羧基反应，转变成酮酸、氨、胺和非必需氨基酸等[13]。必需氨基酸只能通过食物供给，机体不能自身合成。蛋白质分解产生的必需氨基酸被氧化分解将造成损失，影响机体蛋白质的重新合成[14]。因此，降低必需氨基酸的氧化分解并充分利用必需氨基酸对机体蛋白质合成具有重要作用。

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，除作为蛋白质合成的底物外，一些氨基酸还以信号分子的形式参与机体营养物质代谢的调控，如谷氨酰胺通过NF-κB和PI3K-Akt信号通路参与肠道健康的调控[15]，亮氨酸通过PI3K/Akt-mTOR 途径参与蛋白质周转过程等[4]。在本研究中，选择亮氨酸作为功能性氨基酸的代表，赖氨酸作为一般限制性氨基酸的代表，研究两种氨基酸对奶山羊血清氨基酸代谢、乳蛋白和氨基酸组成的影响。本研究结果显示，与对照组相比，日粮添加RP-Leu 提高了血清BCAA、Ile 和Thr 的浓度，有提高EAA、Leu、Trp 和TAA 浓度的趋势。这与前人的研究结果相似，杨昕涧等[6]发现原奶中添加亮氨酸，可显著提高犊牛血清His、Leu、Thr和EAA浓度，对TAA浓度也有提高的趋势；Zheng 等[16]发现日粮添加亮氨酸增加荷斯坦犊牛血清中Met、Thr、His 和EAA 的浓度。血液氨基酸含量由供给量和利用量决定。氨基酸与葡萄糖代谢密切相关，提高葡萄糖总供应量，可节约体内氨基酸被用于合成葡萄糖的数量，有助于提高氨基酸的利用率[17]。亮氨酸已被证明可通过刺激胰腺α淀粉酶的合成与分泌，提高淀粉在荷斯坦犊牛小肠的消化率，促进碳水化合物的高效利用，提高血糖水平[5]。本研究发现日粮添加RP-Leu 可提高血清Ile、Thr 和BCAA 等生糖氨基酸含量，可能是由于在亮氨酸的作用下，这3种氨基酸更少地作为底物进入三羧酸循环或参与糖异生过程产生葡萄糖[18]。而LEU组血清Pro含量降低可能是因为其前体物α-酮戊二酸更多地参与三羧酸循环，导致Pro合成减少[19]（见图2）。亮氨酸影响氨基酸代谢的另一个可能原因是亮氨酸可抑制EAA的转氨作用和氧化分解[20]。研究表明，亮氨酸可降低犊牛骨骼肌中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性，抑制骨骼肌中EAA 的分解代谢，提高犊牛EAA 的利用效率[7]。

图2 血清氨基酸可能参与糖代谢的代谢途径

本研究结果显示，日粮添加RP-Leu和RP-Lys对乳蛋白合成和氨基酸组成无影响。乳中水解氨基酸表示乳蛋白中氨基酸的组成，BCAA作为一种信号分子，在调节牛乳腺的乳蛋白合成中起着重要作用[21-22]。本研究乳中氨基酸没有受到亮氨酸的影响，可能是由于试验动物处于泌乳中后期，此阶段奶山羊所获养分除满足维持和产奶需要外，还用于恢复产后失去的体重[23]。乳中氨基酸构成相对稳定也是本试验乳蛋白氨基酸组成无显著性差异的重要原因之一，研究发现尽管日粮瘤胃可降解淀粉水平影响乳腺对氨基酸的利用，但是并未改变乳蛋白中氨基酸的构成和含量[24]。虽然有研究表明支链氨基酸参与机体免疫调控[9]，但本研究中Leu未影响泌乳奶山羊机体健康，可以理解为与围产期奶畜由于能量负平衡而导致的脂质代谢疾病相比，泌乳中后期的奶畜身体状况较为良好[25]。

4 结论

本研究表明亮氨酸可提高泌乳奶山羊血清必需氨基酸中生糖氨基酸的含量，但亮氨酸调控血液氨基酸代谢的机理仍不明确，后续应考虑利用多组学技术解释相关机理。