低水平缩合单宁对以豆粕和苜蓿为底物的体外发酵特性的影响

■黄小乘 刘思扬 田怡豪 王宣力 李成云，2，3*

（1.延边大学农学院，吉林 延吉133002；2.中国延边黄牛种质资源开发利用学科创新引智基地，吉林 延吉133002；3.东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心，吉林 延吉133002）

缩合单宁（condensed tannins，CT）又称作原花色素，是羟基黄烷-3-醇和羟基黄烷-3，4-醇，通过C4-C8或C4-C6的C-C键缩合而成的缩合物[1]。当瘤胃内的酸碱度为5～7时，缩合单宁能够与蛋白质稳定结合，形成不能被瘤胃微生物分解利用的缩合单宁-蛋白质结合物，当此结合物到达真胃（酸碱度为2.5）和小肠（酸碱度为8～9）时，会被真胃蛋白酶和胰蛋白酶快速分解，形成容易被机体吸收的小分子物质，从而达到保护过瘤胃蛋白的作用[2]。添加低水平的缩合单宁有助于菌体蛋白的合成，提升进入小肠中的非氨态氮物质的含量，提高动物生产性能[3]。并且减少了瘤胃内泡沫与气体的生成，可以预防反刍动物患瘤胃臌胀症[4]。同时，缩合单宁能够有效降低甚至抑制瘤胃内蛋白质分解菌群的生长，降低蛋白质分解菌的数量，达到保护过瘤胃蛋白的目的[5]。但这种效果和单宁浓度有关，单宁浓度过高可能影响到瘤胃降解率[6]。研究表明，当饲喂的缩合单宁含量超过3%就可能降低山羊的采食量，影响饲料在瘤胃内的降解和饲料的整体消化率，降低饲料的营养价值[7]。

现在的反刍动物饲料中，豆粕是主要的氮源精饲料，苜蓿干草是主要的氮源粗饲料，在饲粮中添加缩合单宁可以达到改善发酵特性的目的[8]。缩合单宁对不同氮源饲料的作用效果有所差异，本研究分别以豆粕和苜蓿干草为底物，旨在探索在精饲料和粗饲料这两种类型的底物中，添加不同水平缩合单宁（0、0.3%、0.6%、0.9%）对延边黄牛体外发酵特性的影响，以期筛选出豆粕和苜蓿干草的缩合单宁最佳添加比例，为在精饲料和粗饲料中添加缩合单宁调控反刍动物瘤胃发酵提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

缩合单宁：纯度为98%以上的分析纯试剂，由国药集团化学试剂有限公司提供。

豆粕（soybean meal）：由延边朝鲜族自治州农业科学院提供，经过微型植物粉碎机粉碎，过40 目筛，4 ℃避光保存，做好标记备用。

苜蓿（Medicago sativa）：于2020 年9 月初在吉林省延边朝鲜族自治州草原管理站采集样品，用齐地面刈割法取样，用保鲜盒带回实验室冷冻干燥，粉碎后过40目筛，4 ℃避光保存，做好标记备用。

消化袋：选用60 mm×90 mm，孔径50 μm的尼龙袋。

体外培养瓶：500 mL的锥形瓶，开口用橡胶塞密封并连接250 mL的玻璃注射器。

人工唾液组分：每10 L 纯化水中添加NaHCO398 g、Na2HPO4·12H2O 93 g、NaCl 4.7 g、KCl 5.7 g、MgSO4·7H2O 1.2 g、无水CaCl20.4 g。先将除了无水CaCl2以外的其他溶剂溶于纯化水中并稀释至刻度，最后加入0.4 g无水CaCl2。人工唾液用来模拟牛口腔环境，主要模拟唾液中的无机成分，用于后续人工瘤胃营养液的配制。

1.2 试验动物

在延边大学农学院牧场选用4 头健康无病的延边黄牛公牛，体重（405.1±22.9）kg，均安装永久瘤胃瘘管。每日08：00、18：00进行饲喂。常规光照，自由采食、饮水和活动。基础饲粮按照美国NRC（2000）配制。试验饲粮组成及营养水平见表1。

表1 试验饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.3 试验设计

试验分别以豆粕和苜蓿干草为底物，分别添加不同水平（0、0.3%、0.6%、0.9%）缩合单宁，将0 添加（不添加缩合单宁）的设为对照组，0.3%、0.6%、0.9%添加水平的设为处理组，即：豆粕0.3%缩合单宁组，简称豆粕0.3%组；豆粕0.6%缩合单宁组，简称豆粕0.6%组；豆粕0.9%缩合单宁组，简称豆粕0.9%组；苜蓿0.3%缩合单宁组，简称苜蓿0.3%组；苜蓿0.6%缩合单宁组，简称苜蓿0.6%组；苜蓿0.9%缩合单宁组，简称苜蓿0.9%组。共8组，每组3个重复。

1.4 试验方法

1.4.1 底物称量

准确称取豆粕和苜蓿干草各2 g，分别加入不同水平的缩合单宁，以及0.10 g 玉米粉末（提供能量），混匀后放入带有编号的消化袋里。再将消化袋分别置于有相应编号的体外培养瓶中。

1.4.2 瘤胃液采集

在晨饲前用瘤胃抽取器经瘤胃瘘管采集4 头供试牛的瘤胃液各200 mL，用12层纱布过滤后，置于灭菌器皿中充分混合（整个过滤过程皆在39 ℃水浴锅中进行），并迅速放入39 ℃的保温箱中带回实验室。

1.4.3 体外培养

体外培养参照Menke 等[9]的方法，并结合体外消化袋技术进行体外发酵试验。瘤胃液与人工唾液按照1∶2 的比例（瘤胃液40 mL，人工唾液80 mL）混合，同时通入CO2并用磁力搅拌器搅拌，制成培养液。迅速将培养液置于按照试验设计编号的体外培养瓶中（内含相应试验样品底物），用橡胶塞密封，在39 ℃恒温振荡培养箱中培养24 h。

1.5 发酵特性的测定

在发酵24 h 后，读取玻璃注射器活塞处刻度值，记录发酵产气量；将瘤胃发酵液倒入100 mL的离心管中，立即用PHS-3C 型酸度计对发酵液pH 进行测定；利用靛酚比色法测定氨态氮（NH3-N）的含量[10]；用气相色谱外标法测定挥发性脂肪酸（VFA）含量；利用三氯醋酸（TCA）沉淀蛋白法[11]测定微生物蛋白（MCP）的含量。

1.6 数据处理

数据用Excel 2010软件进行数据记录和预处理，再用SPSS 19.0 进行单因素分析，均值的多重比较采用LSD 和Duncan’s 法进行分析，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 低水平缩合单宁对延边黄牛体外发酵pH 的影响（见表2）

表2 低水平缩合单宁对延边黄牛体外发酵pH的影响

从表2 可知，豆粕0.9%组pH 显著低于豆粕对照组（P＜0.05）。豆粕0.3%组和豆粕0.6%组pH 与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。苜蓿0.6%组与苜蓿0.9%组之间pH 差异不显著（P＞0.05），但均显著低于对照组和苜蓿0.3%组（P＜0.05）。随着缩合单宁添加量的升高，pH 整体呈下降的趋势，各处理组的pH 在正常范围内变化并且可以满足瘤胃微生物正常代谢的需要。

2.2 低水平缩合单宁对延边黄牛体外发酵总产气量、NH3-N含量以及MCP含量的影响（见表3）

表3 低水平缩合单宁对延边黄牛体外发酵总产气量、NH3-N含量以及MCP含量的影响

由表3 可知，豆粕0.6%组与豆粕0.9%组之间总产气量差异不显著（P＞0.05），但均显著低于豆粕对照组和豆粕0.3%组（P＜0.05）。苜蓿0.6%组与苜蓿0.9%组之间总产气量差异不显著（P＞0.05），但均显著低于苜蓿对照组（P＜0.05）。各组发酵产气量整体随着缩合单宁添加水平的上升呈下降的趋势。

豆粕0.3%组NH3-N含量与豆粕对照组差异显著（P＜0.05），豆粕其他各组NH3-N含量均与豆粕对照组差异不显著（P＞0.05）。苜蓿0.6%组相较于苜蓿对照组有所升高（P＞0.05）。不同氮源中添加低水平缩合单宁对延边黄牛体外发酵NH3-N 含量的影响均在合理范围内，可以满足瘤胃微生物正常生长的需要。

豆粕各组之间体外发酵MCP 含量差异不显著（P＞0.05）。苜蓿缩合单宁添加组体外发酵MCP 含量均显著低于对照组（P＜0.05），且各缩合单宁添加组之间差异不显著（P＞0.05）。

2.3 低水平缩合单宁对延边黄牛体外发酵VFA含量的影响（见表4）

表4 低水平缩合单宁对延边黄牛体外发酵VFA含量的影响

由表4 可知，豆粕0.9%组TVFA 含量显著低于豆粕对照组（P＜0.05）。豆粕缩合单宁添加组乙酸含量显著低于豆粕对照组（P＜0.05），各添加组之间差异不显著（P＞0.05）。TVFA和乙酸含量随着缩合单宁添加量的增多，整体呈下降的趋势。豆粕缩合单宁添加组丙酸含量与豆粕对照组相比差异不显著（P＞0.05），且随着缩合单宁添加量的增多，整体呈上升的趋势。豆粕0.9%组丁酸含量显著低于豆粕对照组（P＜0.05）。豆粕缩合单宁添加组乙酸/丙酸值随着缩合单宁添加量的增多呈下降的趋势。

苜蓿0.9%组TVFA含量和乙酸含量均显著低于苜蓿对照组（P＜0.05）。从整体上来看，随着缩合单宁添加量的增加，苜蓿各组TVFA 和乙酸含量呈下降的趋势，丙酸的含量随缩合单宁添加量的增多而增加，苜蓿0.9%组与苜蓿对照组之间差异显著（P＜0.05）。缩合单宁量的添加对丁酸含量的影响较小，苜蓿各组之间均与苜蓿对照组差异不显著（P＞0.05）。乙酸/丙酸值随着缩合单宁量的添加整体呈下降趋势。

3 讨论

3.1 低水平缩合单宁对延边黄牛体外发酵pH的影响

pH 是反映瘤胃发酵水平的一项重要指标，它能综合反映出瘤胃微生物的代谢产物中产生、吸收、排除及中和有机酸的状况[12]。据研究表明，瘤胃pH 正常范围在5.00～7.50[13]，在本试验中，各处理组的瘤胃液pH 均为弱酸性，保持在有利于瘤胃微生物正常活动的范围内。含氮量高的豆粕组pH 相对较低，相比之下，苜蓿组在缩合单宁添加水平相同时pH 高于豆粕组，这可能与二者含氮量或者含有的蛋白质种类不同有关[14]。0.9%缩合单宁添加组的pH均显著低于各自对照组，可能因为本试验中0.9%缩合单宁添加水平对瘤胃微生物菌群起到了调控作用，抑制了瘤胃微生物的生长及微生物酶的活性，从而影响瘤胃正常发酵[5]。王卫云[15]也曾得出相似结论，即不同浓度的单宁对细菌的生长均有不同程度的抑制作用，且抑制效果与缩合单宁浓度成正比。

3.2 低水平缩合单宁对延边黄牛体外发酵总产气量、NH3-N含量以及MCP的影响

产气量是研究反刍动物的瘤胃发酵试验中重要的指标之一，产气量的多少在一定程度上可以反映出瘤胃微生物活性的高低和饲料中有机物的发酵程度[16]。当反刍动物体内产气量过高时，会对动物的健康有不利影响，增加瘤胃膨胀病的患病概率。在本试验中，随着缩合单宁水平的增加，微生物活性被抑制的程度也不断增强，缩合单宁添加量越大，产气量越低。说明缩合单宁可降低发酵底物的降解率，从而控制瘤胃发酵气体的产生[17]。在同一缩合单宁添加水平下苜蓿组的产气量均低于豆粕组，其主要原因可能是两种饲粮中含氮量的不同，缩合单宁与氮的结合影响了总产气量[18]。

NH3-N 的含量在一定的程度上反映出了瘤胃微生物对含氮物质进行分解后产生氨的速度，以及瘤胃微生物对含氮物质的摄取和利用情况。NH3-N 含量过高可以在一定程度上说明瘤胃中有较多的粗蛋白被降解，如果微生物不能够完全利用，过量的NH3-N就会被浪费，使得饲料利用率降低。如果NH3-N含量过低可能说明过瘤胃蛋白在一定程度上有所增加，但可能造成氮的供应无法满足微生物对氮的需求，所以保持NH3-N 含量在一定范围内是维持瘤胃正常发酵的关键[19]。本试验中，苜蓿组随着缩合单宁添加量的增多，NH3-N 含量变化不显著。前人研究表明，将含有高浓度缩合单宁的红豆草干草饲喂山羊，能使其瘤胃中NH3-N 的浓度显著降低[20]。由此可知高浓度的缩合单宁对降低瘤胃NH3-N 含量具有显著效果[21]。但在本试验中这种效果并不明显，这可能是因为缩合单宁的种类和添加浓度不同。

反刍动物瘤胃内的MCP 含量是对评价反刍动物机体营养吸收水平以及动物生产性能的重要指标之一。反刍动物瘤胃中的MCP 的合成量在一般情况下是相对稳定的，它完全可以满足育肥反刍动物的中产产肉量和低产产肉量对蛋白质营养的需要。但是对高产的反刍动物来说，如果只是依靠瘤胃菌体蛋白所提供的氨基酸并不能满足高产反刍动物在生产中对蛋白质的需要量，必须要依靠增加过瘤胃蛋白的量才能够保证其正常的生产[22]。本试验中，豆粕组和苜蓿组中MCP的含量随着缩合单宁的添加量增多呈下降趋势，且在苜蓿组中效果显著，这说明添加高水平缩合单宁对蛋白质起到了保护作用，在一定的程度上降低了微生物氮合成，使得微生物蛋白合成量和生产效率降低[23]。

3.3 低水平缩合单宁对延边黄牛体外发酵VFA含量的影响

饲料中的碳水化合物是动物机体能量的主要来源，而在反刍动物瘤胃中，有55%～95%的碳水化合物经瘤胃微生物的降解，生成葡萄糖、果糖、木糖等，经酵解转化成丙酮酸后进一步分解成VFA和ATP[24]。在瘤胃快速发酵时，会产生大量的TVFA。如果瘤胃内产生的TVFA过量，超过了瘤胃绒毛的吸收能力，TVFA会在瘤胃内累积，降低瘤胃pH，引起奶牛亚急性酸中毒[25]。而缩合单宁有抑制瘤胃微生物生长以及抵抗生物降解的能力，所以瘤胃细菌、原虫和真菌等微生物对粗纤维、淀粉等碳水化合物的降解也被抑制，TVFA的浓度降低，可以有效预防反刍动物瘤胃酸中毒[26]。Slianikove等[27]的试验发现，给反刍动物饲喂栋树、白坚木等含有缩合单宁的植物，其瘤胃中TVFA的含量降低，可减少反刍动物对VFA 快速升高而引起的不适。本次试验的结果显示，豆粕和苜蓿缩合单宁添加组随着缩合单宁添加量的增加，TVFA和乙酸的含量降低，丙酸的含量增加，在缩合单宁添加量为0.9%时达到最适要求。Ngamsaeng等[28]也得出相似的结果。

4 结论

综上所述，各处理组的pH在正常范围内变化，均可以满足瘤胃微生物正常代谢的需要。豆粕0.9%组、苜蓿0.9%组显著降低了总产气量，对瘤胃膨胀病的预防有一定的作用；显著降低了TVFA的含量，可以有效预防瘤胃酸中毒；并且使MCP 降低，对于过瘤胃蛋白的保护具有一定效果。