羊口疮病毒LAMP-LFD快速检测方法的建立与初步应用

杨 倩，李召仁，鲜思美，2*，包涛涛，3，张 友，梁 倩，顾庆林

(1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病研究所，贵州 贵阳 550025；3.贵州省黔东南州农业农村局，贵州 黔东南 556000)

羊传染性脓疱皮炎，俗称“羊口疮(Orf)”，是由羊口疮病毒(Orf virus，OrfV)引起的一种急性、接触性人兽共患传染病。OrfV通常可感染所有年龄段的绵羊和山羊，羔羊的发病率高达100%[1]。其他各种反刍动物和哺乳动物，如骆驼、犬、猫以及人等均有OrfV感染的报告[2]。近年来，已有多个国家相继报道OrfV感染病例[3～5]。在我国东北、西北以及中部等地区也均有Orf疫情暴发[2,6]。Orf疫情的暴发，制约了养羊场的经济效益，并为世界公共卫生安全带来巨大隐患。因此，建立针对OrfV快速、简便的诊断方法，以期达到早发现、早预防的目的。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种在恒温条件下利用链置换DNA聚合酶实现核酸快速扩增的方法[7]。2008年，KIATPATHOMCHAI等[8]首次引入横向流动试纸条(lateral flow dipstick，LFD)用于LAMP扩增产物的检测。该LAMP-LFD技术原理是将LAMP的上游内引物5′端用生物素(biotin，BIO)标记，然后在内引物扩增有效区段设计1条用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的DNA探针，LAMP扩增结束后，BIO标记的LAMP扩增产物与FITC标记的探针特异性杂交，可以在5 min内于LFD上完成显色和结果判断。该方法不依赖特殊仪器设备，仅需水浴锅或加热器即可快速检测目的基因，大大节省了检测成本和时间，适用于基层及现场使用。目前，该LAMP-LFD技术已成功应用于多种病原的检测[9-11]，但对OrfV的LAMP-LFD检测尚未见报道。

本研究根据OrfV的B2L基因保守区段设计1套LAMP引物和1条FITC标记探针，通过各反应条件的优化建立了OrfV的LAMP-LFD检测方法，同时与常规PCR在敏感性和临床样本的检出符合率方面进行比较研究，旨在为临床OrfV感染的诊断提供一种新型的快速检测手段。

1 材料与方法

1.1 主要材料pMD18-T-B2L重组质粒，口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)O型、亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗，山羊痘病毒(goatpox virus，GTPV)，丝状支原体山羊亚种(Mycoplasmamycoidessubsp.capri，Mmc)，小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)，29份疑似Orf病料均由贵州大学动物疫病研究室保存。

1.2 主要试剂Bst DNA 2.0聚合酶购自NEB公司；横向流动试纸条购自Millenia Biotec GmbH公司；dNTP Mix、DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒小量提取试剂盒购自OMEGA公司；RevertAidTM预混液购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 引物的设计与合成根据GenBank登录的OrfV-B2L的基因序列(Gu320351)，利用在线软件Primer Explorer 4.0，设计用于LAMP扩增的外引物OrfV-F3/OrfV-B3、内引物OrfV-FIP/OrfV-BIP 4条特异性引物，在上游内引物OrfV-FIP的5′端用BIO标记；同时设计合成1条经FITC标记的特异性探针OrfV-HP，用于LFD的杂交试验(表1，图1)。以上引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，探针由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。同时引物OrfV-F3/OrfV-B3用于普通PCR扩增的特异性引物，预期扩增片段长度约为211 bp。

图1 LAMP-LFD引物设计示意图

表1 引物信息

1.4 核酸提取根据质粒小量提取试剂盒说明书提取pMD18-T-B2L质粒DNA；根据DNA提取试剂盒说明书提取GTPV和Mmc的DNA；根据RNA提取试剂盒提取FMDV和PPRV的RNA，同时将RNA反转录为cDNA；将所提取的DNA/cDNA于-20℃保存备用。

1.5 LAMP-LFD反应体系的优化与建立

1.5.1温度优化 25 μL LAMP反应体系：1 μL Bst DNA 2.0聚合酶(8 U/μL)，2.5 μL 10×等温扩增缓冲液，3.5 μL dNTP Mix(10 mmol/L)，1.5 μL MgSO4(100 mmol/L)，OrfV-F3/OrfV-B3(20 μmol/L)各2 μL，OrfV-FIP/OrfV-BIP(5 μmol/L)各1 μL，2 μL DNA模板，以及8.5 μL ddH2O。将以上混合物在反应温度61～66℃依次递增下扩增1 h后，经80℃热激5 min终止反应。产物进行2%琼脂糖凝胶电泳(AGE)检测，依据扩增效果以确定最佳退火温度。

1.5.2时间优化 在最佳反应温度下，其他条件不变，反应时间按10，20，30，40，50，60 min优化，取扩增产物进行2% AGE检测，依据扩增效果确定最适反应时间。

1.5.3内外引物浓度比优化 通过控制变量法，设置内外引物浓度比为1∶1，2∶1，4∶1，8∶1，16∶1进行反应体系的优化，取扩增产物进行2% AGE检测，依据扩增效果确定最佳内外引物浓度比。

1.5.4聚合酶浓度优化 通过控制变量法，设置Bst DNA 2.0聚合酶浓度分别为80，160，240，320，400，480 U/mL进行反应体系的优化，取扩增产物进行2% AGE检测，依据扩增效果确定最佳聚合酶浓度。

1.5.5dNTP Mix浓度优化 通过控制变量法，设置dNTP Mix浓度分别为0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mmol/L 进行反应体系的优化，取扩增产物进行2% AGE检测，依据扩增效果确定最适dNTP Mix浓度。

1.5.6Mg2+浓度优化 通过控制变量法，设置Mg2+浓度分别为2，4，6，8，10，12 mmol/L进行反应体系的优化，取扩增产物进行2% AGE检测，依据扩增效果确定最适Mg2+浓度。

1.5.7LFD检测条件的优化 利用已确立的LAMP反应体系及条件，使用BIO标记的OrfV-FIP进行LAMP反应，反应结束后不经过80℃ 5 min 的终止反应，而在反应中加入20 pmol的OrfV-HP探针，分别在63，64，65℃杂交5 min，取杂交后产物5 μL加入到80 μL Tris-buffered saline中，插入试纸条，静置5 min后观察结果。BIO标记的LAMP扩增产物与OrfV-HP特异性杂交后形成的复合物会结合在有BIO抗体的检测线上，判读为阳性；未杂交的OrfV-HP与胶体金标记的抗FITC抗体形成不含BIO的复合物通过检测线，结合在质控线上，判读为阴性。

1.6 LAMP-LFD特异性试验分别以OrfV-B2L、GTPV、FMDV、PPRV、Mmc的DNA/cDNA为模板进行LAMP扩增，利用AGE及LFD分别检测扩增产物，以分析该方法的特异性，同时设立阴性对照。

1.7 LAMP-LFD敏感性试验将提取的OrfV-B2L质粒DNA进行10倍梯度稀释，以4.95×104～4.95×10-3拷贝/μL为模板，按照优化后的反应条件进行LAMP扩增，扩增产物分别经AGE和LFD检测。同时将相同模板利用OrfV-F3/OrfV-B3特异性引物进行PCR扩增，PCR反应条件：95℃ 3 min；95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃ 10 min，扩增产物进行1.2% AGE检测。比较LAMP-LFD和PCR方法的敏感性。

1.8 LAMP-LFD重复性试验取5个不同时间提取的OrfV-B2L质粒DNA稀释至最低检测浓度(10-2拷贝/μL)，应用LAMP扩增后，扩增产物经AGE及LFD检测，进行批间重复试验；取同一时间提取的OrfV-B2L质粒DNA进行10倍倍比稀释(103～10-2拷贝/μL)，应用LAMP扩增后，扩增产物经AGE及LFD检测，进行批内重复试验。均设立阴性对照。

1.9 临床样品检测将采集的29份临床疑似Orf样品提取DNA，分别进行LAMP-LFD和PCR检测，同时设立阴、阳性对照。

2 结果

2.1 LAMP-LFD反应条件的优化经控制变量法优化LAMP-LFD的各反应条件。结果显示，最终确定LAMP体系为：1.25 μL Bst DNA 2.0聚合酶(8 U/μL)，2.5 μL 10×等温扩增缓冲液，3 μL dNTP Mix(10 mmol/L)，1.5 μL MgSO4(100 mmol/L)，OrfV-F3/OrfV-B3(20 μmol/L)各0.5 μL，OrfV-FIP/OrfV-BIP(5 μmol/L)各1 μL，2 μL DNA模板，以及11.75 μL ddH2O；LAMP反应最佳反应温度为64℃，最佳反应时间为30 min(图2)。LFD检测探针最适结合温度为65℃(图3)。

M.DL2000 DNA Marker; NC.阴性对照; 1～6.61，62，63，64，65，66℃; 7～12.10，20，30，40，50，60 min; 13～17. 1∶1,2∶1,4∶1,8∶1,16∶1; 18～23.80，160，240，320，400，480 U/mL; 24～35.0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，2，4，6，8，10，12 mmol/L

1～3.63，64，65℃

2.2 LAMP-LFD特异性试验在同一条件下，分别以OrfV-B2L、GTPV、FMDV、PPRV、Mmc的DNA/cDNA为模板进行LAMP扩增。结果显示，以OrfV-B2L为模板的LAMP扩增产物经AGE及LFD检测均为阳性，其他模板及阴性对照均呈阴性(图4)，表明该方法特异性较强。

M.DL2000 DNA Marker; NC.阴性对照(以蒸馏水为模板);1.OrfV-B2L;2.GTPV;3.FMDV;4.PPRV; 5.Mmc

2.3 LAMP-LFD敏感性试验对提取的OrfV-B2L质粒DNA进行10倍梯度稀释，以相同模板分别进行LAMP及PCR扩增。结果表明，LAMP扩增后，AGE和LFD的检测最低模板浓度为4.95×10-2拷贝/μL；而PCR扩增后，检测的最低模板浓度为4.95×10 拷贝/μL(图5)。因此，LAMP-LFD的敏度性是利用外引物OrfV-F3/OrfV-B3建立的PCR方法的1 000倍，敏感性较高。

M.DL2000 DNA Marker; NC.阴性对照(以蒸馏水为模板);1～8.pMD18-T-B2L质粒稀释浓度分别为4.95×104～4.95×10-3 拷贝/μL

2.4 LAMP-LFD重复性试验批间重复试验以不同时间提取的模板稀释至最低检测浓度(10-2拷贝/μL)后进行LAMP扩增，产物经AGE和LFD检测结果均为阳性(图6 A，B)；批内重复试验以同一时间提取的模板10倍倍比稀释至最低检测浓度后，产物经AGE和LFD检测结果均为阳性(图6 C，D)。批间试验及批内试验均显示LAMP-LFD重复性及稳定性较好。

M.DL2000 DNA Marker;NC.阴性对照(以蒸馏水为模板);1～5.不同时间提取质粒DNA的最低检测浓度作为模板;6～11.同一时间提取质粒DNA倍比稀释后作为模板

2.5 临床检测结果利用本研究建立的LAMP-LFD方法及PCR方法对临床29份疑似羊口疮样品进行检测，结果显示，LAMP-LFD检测结果与PCR检测结果一致，阳性样本数均为17份(图7)。两种方法检测符合率达100%，表明本研究建立的LAMP-LFD方法可应用于临床实践。

M.DL2000 DNA Marker;1～29.临床样本;+.阳性对照;NC.阴性对照(以蒸馏水为模板)

3 讨论

近年来，随着人们生活质量的提高，对羊产品的需求增加，促进了养羊业的发展。然而，对于羔羊的Orf高发病率以及继发感染，给养羊业带来了巨大经济损失。因此，需要建立一种快速、简便、可靠的检测方法，用于OrfV的检测。B2L基因是OrfV的第11个开放阅读框，其编码的42 kDa蛋白是病毒核衣壳主要结构蛋白之一。B2L基因高度保守，在不同分离株中序列同源性可达97%～98%[12]。因此，本研究以OrfV B2L基因为靶基因，建立高效特异检测OrfV的LAMP-LFD方法，对该病的诊断及防治具有重要意义。

目前，针对OrfV的检测方法有PCR、qPCR、ELISA、LAMP及间接免疫荧光(IFA)等[13-16]。对于检测技术的实用性和推广性来说，其灵敏度和特异性、检测时间以及操作的便捷性是实践中所追求的重要指标。本研究建立的LAMP-LFD检测方法特异性强，并未扩增出其他几种病原核酸，灵敏度是常规PCR检测方法的1 000倍。王海峰[16]基于OrfV VIR基因建立的LAMP方法灵敏度也是常规PCR法的1 000倍，与本研究结果一致。LAMP-LFD检测OrfV时，从核酸扩增到结果判读只需40 min 即可完成；柴方超等[17]建立的应用于迟缓爱德华菌检测的LAMP-LFD法，检测时间只需35 min；LIU等[11]建立的检测沙门菌的LAMP-LFD法，检测时间在50 min左右；总体来说，LAMP-LFD检测方法所需时间都较短，比常规PCR节约了近2 h，也较qPCR、ELISA等方法快速。该LAMP-LFD技术不需要特殊仪器设备和实验室条件，如PCR仪、荧光显微镜等，只需恒温水浴即可完成，相对于其他几种检测方法具有明显优势。

LAMP扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、目视比浊、钙黄绿素测定、目视荧光检测以及LFD等方法来判定。琼脂糖凝胶电泳法检测时需要接触溴化乙锭等有毒试剂，且容易产生气溶胶污染导致假阳性。由于LAMP引物多，产物复杂，如核酸模板含量低时，比浊等方法存在主观上的弊端。另外目视荧光检测判定方法中使用的一些染料如SYBR Green可与扩增产物核酸结合，影响扩增产物的量[17]。同时上述几种方法均不能区分特异性扩增和非特异性扩增。LFD检测方法对LAMP结果的判定是基于序列间特异性杂交，利用FITC标记探针与BIO标记LAMP产物特异性结合，短时间内得到直观且客观的试验结果，在保证检测灵敏度的同时避免了其他方法的弊端。

综上，本研究根据OrfV的B2L基因建立的LAMP-LFD技术，能够特异性的检测OrfV，检测时间只需40 min，且该方法特异性强、灵敏度高，临床样本检出与常规PCR符合率为100%，不需要特殊仪器设备和实验室条件，可作为一种新型检测方法应用于现场及基层检测。