兔源F型多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

王锦祥，孙世坤，陈岩峰，陈冬金，桑 雷，谢喜平

(福建省农业科学院 畜牧兽医研究所，福建 福州 350013)

兔巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌感染兔引起的一种传染性疾病，该病是兔的常发病和多发病。临床上，患兔主要表现为呼吸道症状，如咳嗽、流浆液性或脓性鼻涕，也可表现为中耳炎和结膜炎等病症[1-2]。该病常年发生，所有品种和日龄的兔均易感，是危害兔产业发展的重要疾病[1-2]。F型多杀性巴氏杆菌首次分离自火鸡[3]，前期研究表明该菌主要感染禽类，且对禽具有强致病性，能引起禽霍乱[4-5]。2004年，JAGLIC等[6]首次证实F型多杀性巴氏杆菌也存在于兔群中，且该菌通过皮下和滴鼻2种途径攻毒均能引起试验兔的死亡[7]。2012年，张娜等[8]首次报道在我国山东的兔群中分离到F型多杀性巴氏杆菌，该分离菌对兔的致病性也很强，攻毒后对仔兔的呼吸道能造成严重的病理损害，并导致仔兔死亡。此后的研究表明，F型多杀性巴氏杆菌在我国不同地区的兔群中均有流行，且该菌的感染与兔的呼吸道疾病直接相关[9]。由此可见，F型多杀性巴氏杆菌对兔具有很强的致病性，如果其在兔群中广泛流行必将阻碍兔产业的发展。因此，建立F型多杀性巴氏杆菌的快速检测方法，掌握该菌在兔群中的流行情况，有助于实现对该菌的有效防控，对保障兔产业的发展具有重要意义。目前，用于F型多杀性巴氏杆菌的实验室检测方法有细菌分离鉴定[8]、双重PCR方法[10]和多重PCR方法[11]，还未见LAMP方法的报道。本试验针对编码F型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原的fcbD基因的保守序列设计了外引物和内引物，建立了检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的LAMP快速检测方法，为兔源F型多杀性巴氏杆菌的快速检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株兔源A型、D型和F型多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,P.multocida)、支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica,B.bronchiseptica)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia,K.pneumonia)、大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)等临床分离株由本实验室分离保存。

1.2 主要试剂Brain Heart Infusion购自Oxoid公司；EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(EE161-01)购自北京全式金生物技术有限公司；荧光及可视化LAMP试剂盒(200921W)购自北京天恩泽基因科技有限公司。

1.3 引物设计与合成根据GenBank登录的编码F型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原的fcbD基因(AF302467)，利用在线软件PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/e/)设计了2对特异性引物。外引物序列为fcbD-F3：5′-GCCTGTTTGGTCAATCAGAA-35′/fcbD-B3：5′-GTTGTGGTGCCATATCGC-3′；内引物序列为fcbD-FIP：5′-TTGCACAATGGTAAGTAAGTTTTCCACAA-ACTACCCATTTGAAGTC-3′/fcbD-BIP：5′-GGA-TATCAATTGTGTGCAGTCAGATCGAGACA-AAATCATACTTTGC-3′。引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。

1.4 LAMP方法的建立按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit说明书，提取兔源F型多杀性巴氏杆菌的基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，利用针对F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因的特异性LAMP引物建立检测F型多杀性巴氏杆菌的LAMP方法。LAMP方法反应体系为：4×荧光及可视化LAMP MagicMix 5 μL，基因组DNA 1 μL，外引物fcbD-F3/fcbD-B3(10 μmol/L)各0.4 μL，内引物fcbD-FIP/fcbD-BIP(10 μmol/L)各3.2 μL，灭菌ddH2O 6.8 μL，共计20 μL。LAMP方法反应条件为：65℃ 90 min。反应结束后，观察反应产物的颜色，并将反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5 LAMP方法的优化将反应体系中混合引物的终浓度保持为3.4 μmol/L不变，将外引物和内引物的浓度比设为1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7和1∶8，将反应温度设为62，63，64，65，66，67，68℃，将反应时间设为30，45，60，75，90，105 min，对LAMP方法进行优化，确定最佳的反应条件。

1.6 LAMP方法的特异性试验按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit说明书，分别提取兔源A型、D型和F型多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的基因组DNA。分别以这些细菌的基因组DNA为模板，同时设置阴性对照，应用建立的LAMP方法进行检测，验证该方法的特异性。

1.7 LAMP方法的敏感性试验将兔源F型多杀性巴氏杆菌的基因组DNA进行连续的10倍倍比稀释，使LAMP反应体系中的DNA模板浓度为1×108～1×100拷贝/μL，应用建立的LAMP方法进行检测，验证该方法的敏感性。

1.8 LAMP方法的重复性试验取60份已知结果的病死兔肺脏样品，平均分为3组，每组20份(A型多杀性巴氏杆菌样品3份、D型多杀性巴氏杆菌样品3份、F型多杀性巴氏杆菌样品3份、支气管败血波氏杆菌样品2份、肺炎克雷伯菌样品2份、大肠杆菌样品2份、金黄色葡萄球菌样品2份和阴性样品3份)。按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit说明书分别提取上述样品的基因组DNA，应用建立的LAMP方法分3批次检测这些样品，根据检测结果统计批内和批间变异系数，评估该方法的重复性。

1.9 临床样品的检测取90份来自福建省不同地区养兔场病死兔的肺脏样品，按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit说明书分别提取上述样品的基因组DNA。应用本试验建立的LAMP方法和已报道的双重PCR方法[10]同时检测这些样品，比较两种检测方法的结果，评估该LAMP方法的临床实用性。

2 结果

2.1 F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因的扩增结果显示，扩增结果可通过肉眼判读，阳性样品的产物为蓝色，而阴性样品的产物为浅蓝色(图1)。进一步将扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，阳性样品的扩增产物为特征性的阶梯状条带，而阴性样品则无此特征性条带(图1)。

M.DL2000 DNA Marker;1.F型多杀性巴氏杆菌;2.阴性对照

2.2 LAMP方法的优化在LAMP方法建立的基础上，对该方法的反应条件进行优化。结果显示，反应体系中引物终浓度保持为3.4 μmol/L不变，外引物和内引物的浓度比为1∶6～1∶8时，该LAMP方法扩增效果较优，本试验取中间值即1∶7为该方法的最优外引物和内引物的浓度比(图2)；当反应温度为65℃时，该LAMP方法扩增效果最优(图3)；当反应时间为30 min时，该LAMP方法有扩增，且该LAMP方法的扩增效果随扩增时间的增加而增强，因有些临床样品中目的基因的含量可能较低，为了使该LAMP方法既有较好的扩增效果(不产生假阴性)又能实现快速检测的目的，本试验选取60 min作为最佳反应时间(图4)。综上所述，该LAMP方法的最佳反应条件确定为：外引物和内引物的浓度比为1∶7，反应温度为65℃，反应时间为60 min。

M.DL2000 DNA Marker;1～6.1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8

M.DL2000 DNA Marker;1～7.62，63，64，65，66，67，68℃

M.DL2000 DNA Marker;1～6.30，45，60，75，90，105 min

2.3 LAMP方法的特异性试验结果显示，该LAMP方法仅对兔源F型多杀性巴氏杆菌有扩增，对其他常见兔源病原菌包括，A型和D型多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌以及阴性对照(灭菌ddH2O)均无扩增(图5)。结果表明，该LAMP方法特异性强。

M.DL2000 DNA Marker;1.F型多杀性巴氏杆菌;2.A型多杀性巴氏杆菌;3.D型多杀性巴氏杆菌;4.支气管败血波氏杆菌;5.肺炎克雷伯菌;6.大肠杆菌;7.金黄色葡萄球菌;8.阴性对照

2.4 LAMP方法的敏感性试验结果显示，该LAMP方法的最低检出限为1×102拷贝/μL，比双重PCR方法的高10倍，表明该方法具有良好的敏感性(图6)。

A,B.LAMP方法检测结果;C.双重PCR方法检测结果 M.DL2000 DNA Marker;1～9.1×108～1×100 拷贝/μL的F型多杀性巴氏杆菌基因组DNA模板;10.阴性对照

2.5 LAMP方法的重复性试验结果显示，3批次的检测结果均与已知结果完全一致，表明该LAMP方法具有良好的重复性。

2.6 临床样品的检测该LAMP方法检出兔源F型多杀性巴氏杆菌阳性样品6份，阴性样品84份，检测结果与双重PCR方法的检测结果完全一致，表明该LAMP方法准确性高，该方法临床实用性好。

3 讨论

兔巴氏杆菌病是兔的重要疫病，该病能通过飞沫、污染的饲料和饮水等在兔群中快速传播，各品种和日龄的兔均易感，危害严重[1-2]。已有研究表明，兔巴氏杆菌病主要由A型和D型多杀性巴氏杆菌引起[12-13]。然而，近年来F型多杀性巴氏杆菌感染兔的多发及该菌对兔表现出的强致病性使兔巴氏杆菌病的病因更加复杂，也使该病的确诊更加困难。

LAMP首次建立于2000年，是一种新型的核酸快速扩增方法[14]，该方法与传统的PCR不同，可以在恒温条件下实现核酸的扩增，而不需要在变性、退火和延伸3个温度条件下进行，且该方法的扩增结果可通过简单的设备(紫外灯)判读或通过肉眼直接判读。因此，自LAMP建立以来已广泛地应用于畜禽疫病的快速检测[15-17]。多杀性巴氏杆菌血清型众多，根据荚膜抗原的不同可将其划分为5种血清型(A、B、D、E和F)，且各血清型菌株之间无交叉免疫[18]。fcbD基因是F型多杀性巴氏杆菌的特异性基因，其编码的是F型多杀性巴氏杆菌荚膜成分中的软骨素[11]。已有研究表明，基于fcbD基因能建立特异的鉴定F型多杀性巴氏杆菌荚膜血清型的多重PCR方法和检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的双重PCR方法[10-11]。由此可见，以该基因为目的基因能建立特异的检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的LAMP方法。

本试验根据fcbD基因的保守序列设计了2对引物，建立了检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的LAMP方法。该方法对常见兔源病原菌，包括A型和D型多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均无交叉反应，特异性强。此外，该方法还易于推广应用。由此可见，该方法的建立为兔源F型多杀性巴氏杆菌的快速检测提供了依据。