一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备及效果评价

刘光辉

（滨州职业学院，山东 滨州 256603）

1周龄内仔猪因其肠道内尚未建立稳定的微生态系统，自身抵抗力较低，对外界环境刺激敏感，易受各种病原微生物的侵袭和各种应激因素的影响[1]。引起仔猪腹泻的传染性因素主要是指传染性病原，有病毒性和细菌性。而细菌性腹泻主要是由大肠杆菌引起，其中产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic escherichia coil，ETEC）是最主要的致病菌，主要发生于 1周龄内仔猪，以 1～3日龄最为常见，发病率和死亡率均很高，给养猪业带来重大损失[2]。卵黄抗体（lmmunoglobulin of yolk，IgY）是一种从免疫禽类后，从禽蛋中提取的特异性杭体，蛋鸡免疫后一个月内可获得的IgY抗体量是免疫兔子的18倍[2]，因此，制备一种除疫苗之外的生物制品，并且即简单经济，又能够快速获得足量抗体效价使机体免受感染或获得最大保护，卵黄抗体无疑是一种良好的选择[3-4]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试蛋鸡 采用仔猪大肠杆菌 K88、K99双价基因工程活疫苗免疫SPF蛋鸡。

1.1.2 免疫抗原 采用当地仔猪大肠杆菌性腹泻发病猪肠道分离物、肠毒素及黏附性菌毛蛋白混合成免疫原对SPF蛋鸡进行免疫。

1.1.3 提取复合含卵黄抗体 在免疫过程中喂食屎肠球菌Anp01（Enterococcus faecium Anp 01）及中药混合物[5]，提高被免疫鸡的免疫力，然后收集其所产鸡蛋，从其蛋黄中提取抗仔猪大肠杆菌性腹泻复合卵黄抗体。

1.2 方法

1.2.1 免疫原制备 采用本地的患仔猪大肠杆菌性腹泻或流行性腹泻比较严重的仔猪进行时捕杀，取出小肠组织剪碎、研磨，用于提取和纯化，加 0.01MPBS（pH7.5）稀释，反复冻融，离心，取上清液加入6 % PEG-6000和2 % NaCl，放置后再离心，将沉淀重悬于PBS中，离心后取上清液进行超速离心。将沉淀重悬于PBS中，即为产肠毒素大肠杆菌、肠毒素及黏附性菌毛蛋白混合免疫原。

1.2.2 对产蛋鸡进行免疫 用上述制备的免疫原对 SPF产蛋鸡进行肌肉免疫。程序为：取 18～20周龄的 SPF蛋鸡，饲喂一周后，进行首次免疫，所述的免疫的方法为：免疫鸡分别分点注射仔猪大肠杆菌病 K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原，在首次免疫后第 14天、第 28天、第56天分别进行2次免疫和3、4次免疫，所述的首次免疫、2次免疫和3、4次免疫的处理方法相同，首免和第 2次免疫，分别注射仔猪大肠杆菌病 K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原1 ml；再隔2周进行第3次免疫，注射疫苗及混合免疫原2 ml；再隔4周后进行第4次免疫，分别注射疫苗及混合免疫原4 ml。

1.2.3 添加屎肠球菌Anp01及中药混合物 免疫鸡在饲喂过程中添加屎肠球菌 Anp01（添加量0.1 %）及中药混合物，中药混合物组成为：生黄芪 15 g、银花 15 g、柴胡 10 g、黄芩 10 g、板兰根 15 g、贯仲 15 g、苍术 10 g、生苡仁 15 g、防风 10 g、生甘草 5 g、藿香 10 g，粉碎饲喂，添加量为10 %，以提高免疫鸡群机体免疫力。

1.2.4 卵黄抗体分离提纯 首免 6周后收集所产鸡蛋，经 75 % 酒精消毒后，用卵黄分离器分离出卵黄，与等量 PBS混合后匀浆，聚乙二醇（PEG-6000）沉淀法提纯卵黄抗体；所述用聚乙二醇（PEG-6 000）沉淀法提纯的程序为：依次分别用3.5 % PEG-6000、8.5 % PEG-6000、12 %PEG-6000对卵黄抗体沉淀 3次，最后用预冷的50 % 乙醇进一步沉淀，收集上液，经0.22 µm滤膜过滤后，所得为纯化后的仔猪大肠杆菌性腹泻抗体IgY。

2 结果与分析

2.1 卵黄抗体的制备结果

实验制备抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体要求纯度≥95 %，琼脂扩散试验测定卵黄抗体效价≥1:64。

2.2 卵黄抗体对仔猪死亡率的影响

取 1日龄未吃初乳仔猪 12头，随机分成 4个小组，分别为攻毒治疗组（4头），攻毒不治疗组（4头），不攻毒治疗组（2头），不攻毒不治疗组（2头）。攻毒所用菌株为产肠毒素大肠杆菌（ETEC）10倍稀释，给攻毒组 0.2 ml/头直接口服，治疗所用卵黄抗体为提纯样品，同样口服饲喂 2 ml/d，对照组饲喂频次数量相等的生理盐水，根据各组临床症状及死亡率及粪便情况来判断TGEV卵黄抗体的治疗效果。

攻毒治疗组、不攻毒治疗组合和对照组仔猪生长正常，饲喂卵黄抗体与否对其生长没有影响，没有出现死亡，攻毒不治疗组 4 d内全部死亡，实验结果见表1。

表1 4组实验仔猪攻毒后死亡对比实验

2.3 卵黄抗体对仔猪攻粪便的影响

攻毒治疗组在攻毒后 1～3 d出现轻度腹泻，第 4天以后恢复正常，攻毒不治疗组仔猪均出现严重的腹泻症状，表现为黄色水泻，仔猪迅速消瘦脱水，而卵黄抗体治疗组第 2天仔猪腹泻症状则明显减轻，排泄出的粪便自黄色稀便转变为黏稠软便，1周后逐渐恢复，未出现死亡情况，实验结果见表2。

表2 4组实验仔猪攻毒后粪便对比实验

3 讨论

仔猪细菌性腹泻具有较强的传染性，并且仔猪感染后死亡率比较高，是养猪业比较棘手的问题。当仔猪感染产肠毒素大肠杆菌后，仔猪的小肠黏膜受损严重，直接影响机体对营养的消化吸收，如果不能第一时间得到治疗，常因剧烈水样腹泻和代谢性酸中毒而死亡。此类疾病必须尽早治疗，以确保达到预期效果[6]。

卵黄抗体制剂为鸡的免疫球蛋自，能够特异性的中和 ETEC致病菌[7]。同时，添加的屎肠球菌和中药混合物对仔猪消化系统有营养和修复作用。可用于治疗临床上由 ETEC感染导致的仔猪腹泻，对于末感染的仔猪可以起到积极的预防和保护作用，有助于第一时间改善仔猪发病状况。

4 结论

制备的仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体可有效预防和治疗仔猪产毒大肠杆菌感染，具有较好的临床应用价值。