祛白片挥发油的GC-MS 分析及其对黑色素瘤细胞B16 脱黑色素模型的影响

段松冷韦元元顾红燕刘俊丽田佳懿刘敏孙路路*

（1.首都医科大学附属北京世纪坛医院药学部，北京100038； 2.临床合理用药生物特征谱学评价北京市重点实验室，北京100038； 3.临床合理用药生物特征谱学评价国际合作联合实验室，北京100038）

首都医科大学附属北京世纪坛医院自制中药制剂祛白片（原名白癜风片）是由蒺藜（炒）、制何首乌、黑芝麻（炒）、补骨脂、女贞子、北沙参、决明子、香橼、赤芍、丹参、桃仁（炒）、红花、独活、苍术（炒）、白芷组成的复方制剂，具有滋补肝肾、活血通络的功效，可用于治疗肝郁肾亏、血虚瘀阻、皮失所养之白癜风，其临床疗效稳定可靠，受到患者广泛好评［1-2］。为实现祛白片制剂成果转化，本研究从其特征图谱入手建立了祛白片的质量标准，并考察了全方药效学。顾红燕等［3-4］研究祛白片对实验性白癜风模型的作用机制，证实了祛白片的抗白癜风作用，并确定药效与促进黑色素形成相关。因祛白片制备工艺为水煎煮，提取过程中全方药材挥发油几乎完全流失。因此，为最大限度地保留处方饮片所有可能的有效成分，进一步提高疗效，本研究采用水蒸气蒸馏法提取祛白片挥发油，GC-MS 联用技术分离鉴定其成分，并用CCK-8 法检测祛白片挥发油对小鼠黑色素瘤细胞B16 的细胞生长、促细胞活力、黑色素合成、酪氨酸酶活性的影响［4］，以期为优化祛白片工艺规程，进一步提高疗效提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Trace 气相-质谱联用仪（美国Thermo Finnigan公司）；MCO-15AC 型CO2培养箱（日本SANYO 公司）；COIC XDS-1B 型显微镜（重庆重光实业有限公司）；RTTDL-40B 型离心机（上海安亭科学仪器厂）；YT-CJ-1ND 型无菌操作台（北京亚泰科隆仪器科技有限公司）。

1.2 试剂与药物 蒺藜（炒）、制何首乌、黑芝麻（炒）、补骨脂、女贞子、北沙参、决明子、香橼、赤芍、丹参、桃仁（炒）、红花、独活、苍术（炒）、白芷饮片均购自北京金崇光药业有限公司，经首都医科大学附属北京世纪坛医院孙路路主任药师鉴定为正品。8-甲氧补骨脂素（8-MOP，批号M3501-1，纯度98%）、过氧化氢（H2O2，批号H1009-100 mL）均购自美国Sigma 公司。

1.3 细胞 小鼠黑色素瘤细胞B16（编号3111C0001CCC000324），购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

2 方法与结果

2.1 GC-MS 分析

2.1.1 挥发油制备 按1 剂祛白片处方量的10%称取所需饮片，按2020 年版《中国药典》 四部2204 挥发油测定法［5-6］，加热处方并保持微沸5 h 至挥发油提取器中油量不再增加，即得（性状为黄色油状物）。

2.1.2 分 析条件 B-5MS 色谱柱（0.25 mm× 30 m，0.25 μm）；程序升温（初始温度50 ℃，保持3 min；5 ℃／min升至250 ℃，保持10 min）；载气高纯氦气；体积流量1.0 mL／min ；进样量0.5 μL；气化温度270 ℃；分流进样，分流比20∶ 1。EI 离子源70 eV；离子源温度200 ℃；全扫描采集模式，质量范围m／z35～450。

2.1.3 结果分析 采用NIST 谱库检索，结合保留时间确认化学成分，按峰面积归一化法进行计算［7-8］。如图1、表1 所示，挥发油水蒸气蒸馏法提取率为0.169 0%，从祛白片挥发油中分离出的66 个峰，确定了53 个化合物，占挥发油的64.30%。

表1 挥发油成分GC-MS 分析结果

图1 挥发油GC-MS图

2.2 药效学研究

2.2.1 模型建立 参考文献［9］报道制备B16 细胞悬液，血球计数板计数，培养液（10%FBS、DMEM、1%P／S）稀释细胞，24、96 孔板铺板，每孔均10 000 个细胞，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，24 h 后更换含0.1 mmol／L H2O2的培养液，与细胞共同孵育4 h 后吸弃培养基，即得脱黑色素细胞，DMEM 清洗1次，更换含不同药物的培养液。

2.2.2 细胞生长状态观察 将细胞分为模型组、溶剂组、8-MOP 组（10、25、50、100、500 μmol／L）、祛白片挥发油组（0、1∶30 000、1∶20 000、1∶16 000、1∶10 000、1∶8 000），模型组细胞造模后同步加入相同体积的培养基，后续与实验组平行；由于挥发油及8-MOP 均是以DMSO 配制所得，故设溶剂组，原液稀释1 000倍，其余操作与实验组平行；8-MOP 组、祛白片挥发油组分别加入相应药物，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24、48 h，在倒置显微镜下观察脱黑色素细胞形态学变化，并在光镜下拍照，结果见图2。由此可知，与模型组比较，祛白片挥发油组作用24 h 后细胞数增加，而48 h 后减少；8-MOP 组作用24、48 h 后细胞数均增加，并呈时间、剂量依赖性。

图2 各组脱黑色素细胞生长（×100）

2.2.3 CCK-8 法检测挥发油对黑色素细胞增殖的影响 取对数生长期B16 细胞，胰酶消化，制成密度为1×104／孔的单细胞悬液，接种于96 孔培养板上，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，按“2.2.1”项下方法建立模型，按“2.2.2”项下分组，另设对照组（不含细胞），每组设5 个复孔，加入相应药物处理24、48 h，吸去上清，更换为含CCK-8 的溶液（CCK-8∶DMEM ＝1∶10），置于培养箱中培养4 h，采用酶标仪在450 nm 波长处测定光密度（OD）值，计算细胞增殖率［10］，结果见图3。由此可知，与模型组比较，祛白片挥发油组细胞增殖率升高（P＜0.01）；与溶剂组比较，8-MOP 组细胞增殖率升高（P＜0.01），提示脱黑色素细胞增殖率与药物浓度呈正相关，8-MOP 组细胞增殖率与作用时间呈正相关，祛白片挥发油组细胞增殖率与作用时间呈负相关。

图3 挥发油对脱黑色素细胞增殖的影响（， n＝3）

2.2.4 NaOH 裂解法检测挥发油对黑色素形成的影响 按“2.2.3”项下方法分组、培养及给药，加入相应药物培养48 h 后弃上清液，PBS（pH 7.4）洗涤2次，加入200 μL含10%DMSO 的1 mol／L NaOH 溶液，80 ℃恒温水浴保温2 h，充分裂解细胞和溶解黑素颗粒，采用酶标仪在490 nm波长处测定OD值，计算促黑色素生成率［11］，结果见图4。由此可知，与模型组比较，作用24 h 后祛白片挥发油组细胞促黑色素生成率升高（P＜0.01），48 h 后除祛白片挥发油1∶30 000 组外继续升高（P＜0.05，P＜0.01）；与溶剂组比较，8-MOP 组细胞促黑色素生成率升高（P＜0.01），提示细胞促黑色素生成率与药物浓度呈正相关，8-MOP 组细胞的促黑色素生成率与作用时间呈正相关，祛白片挥发油组细胞促黑色素生成率与作用时间呈负相关。

图4 挥发油对黑色素形成的影响（， n＝3）

2.2.5 酶标法检测挥发油对酪氨酸酶活性的影响 脱黑色素细胞接种于96 孔板，按“2.2.2”项下分组，加入相应药物处理24、48 h 后弃去培养液，PBS 洗涤2次，每孔加入1%TritonX-100 溶液90 μL，迅速放入-80 ℃冰箱中孵育30 min，随后室温融化使细胞完全破裂，在37 ℃下预温后加入10 g／L L-DOPA 溶液（100 μL／孔），在37 ℃下孵育30 min，采用酶标仪在490 nm 波长检测OD值［12］，计算酪氨酸酶活性促进率，结果见图5。由此可知，与模型组比较，祛白片挥发油组脱黑色素细胞中酪氨酸酶活性升高（P＜0.01）；与溶剂组比较，8-MOP 组脱黑色素细胞中酪氨酸酶活性升高（P＜0.01），提示脱黑色素细胞中酪氨酸酶活性与药物浓度呈正相关，8-MOP 组脱黑色素细胞中酪氨酸酶活性与作用时间呈正相关，而祛白片挥发油组脱黑色素细胞中酪氨酸酶活性与作用时间呈负相关。

图5 挥发油对酪氨酸酶活性的影响（， n＝3）

3 讨论

3.1 祛白片挥发油成分分析 由提取中药挥发油制成的中成药在现代疾病治疗、预防保健中已被广泛应用［13］。本研究采用GC-MS 技术［14］对祛白片挥发油的化学成分及含量进行考察，结果显示，挥发油成分中1-甲基-2，4-二（prop-1-en-2-基）-1-乙烯基环己烷最高，（2E，4E）-癸二烯醛（8.03%）次之，4a-甲基-1-亚甲基-7-（prop-1-en-2-基）十氢萘含量排名第3。分析结果表明，祛白片挥发油成分中含量最高的为脂肪烃类，其次为环烃。将祛白片挥发油成分，与方中君药蒺藜的挥发油［15］比较可知，蒺藜中含量最高的（2E，4E）-癸二烯醛（9.16%）在祛白片挥发油中次高，祛白片挥发油中含量最高的1-甲基-2，4-二（prop-1-en-2-基）-1-乙烯基环己烷在蒺藜的挥发油中没有检测到，方中臣药补骨脂挥发油中含量最多的石竹烯（36.24%）［16］在祛白片中也没有的检测到，可能是在提取祛白片挥发油的过程中，发生了多种复杂的化学变化，使得挥发油在成分和含量上都与单味药成分存在较大差异。

3.2 阳性药物的选择 8-MOP 加长波紫外线或日光照射是治疗白癜风应用最多的一种方法，其临床上应用的口服片剂、胶囊、针剂、酊剂等对白癜风均有一定的治疗作用［17］。由于8-MOP 结构简单、易与DNA 发生作用，生物活性较易发挥作用，故选择其为阳性对照药物，考察祛白片挥发油的抗白癜风作用。

3.3 祛白片挥发油对小鼠黑色素瘤细胞B16 脱黑色素模型的影响 与模型组比较，祛白片挥发油作用24 h 后各剂量挥发油均可使细胞数增加，但作用48 h 后细胞数较之前有所减少。8-MOP 组给药24、48 h 后对脱黑色素细胞的增殖作用呈时间和剂量依赖性。祛白片挥发油对脱黑色素细胞增殖活性及黑色素水平的研究结果与以上情况类似。祛白片挥发油给药48 h 后结果不佳，可能是因为挥发油理化性质较为特殊［18］，在室温下极易挥发，48 h后，挥发油含量已下降，药效也随之降低。祛白片挥发油对B16 细胞脱黑色素模型具有一定的促进生长繁殖和升高黑色素水平的作用。本研究可作为祛白片制备工艺改进的依据，建议在祛白片饮片水提之前进行挥发油的收集以及环糊精包合［19-21］，以提高挥发油的稳定性，增强祛白片的疗效，更好的满足患者的临床需求。