复方红黄口含片成型工艺优化及其耐缺氧作用研究

李婉玉 李琳马慧萍鲁艳梅 石晓峰*张朋朋张家旭董学凤叶倩女

（1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州730000； 2.甘肃省医学科学研究院，甘肃 兰州730050； 3.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院药剂科全军高原损伤防治重点实验室，甘肃 兰州730050）

复方红黄口含片由红景天、黄芪、黄精、枸杞子4 味中药组成，方中君药红景天是防治缺氧和高原反应的最常用中药；补气养阴的黄芪和滋阴益肾的黄精、枸杞子可减缓红景天苦寒药性，同时增强补益功效，并且三者具有耐缺氧、抗疲劳、抗氧化应激等作用［1-3］。

缺氧威胁人体健康，并且城市上班族等脑力工作者因为用脑过度、缺乏锻炼等原因容易产生脑供血不足、氧气利用不足的亚健康问题，故开发具有耐缺氧功能的产品具有很大的应用前景。目前，有上述作用的药物和保健品以西药、红景天提取物或其他单味中药为主［4-6］，并且耐缺氧、抗疲劳双功能保健品中胶囊、饮品占比较大，片剂较少［7］。

本实验在课题组前期研究［8-9］的基础上，研发出适应当下快节奏生活需求、口感优良、服用携带方便、具有耐缺氧作用的口含片，并以外观、口感、硬度、崩解时间为评价指标，采用单因素试验结合正交试验优化其成型工艺，再通过常压耐缺氧实验评价其耐缺氧作用，以期为该复方开发利用提供理论依据。

1 材料

1.1 试剂 红景天（批号20190127，陇南市惠康中药材有限公司）；黄芪（批号20180711）、黄精（批号20180823）、枸杞子（批号20180823）（安宁杏林药材批发部），经甘肃省医学科学研究院石晓峰主任药师检验鉴定为正品，均符合2020 版《中国药典》 一部规定。无水乳糖（河南春祥化工产品有限公司，批号18102206）；微晶纤维素（山东光大科技发展有限公司，批号20171201）；阿斯巴 甜（江苏汉光甜味剂有限公司，批号W17032015）；硬脂酸镁（安徽山河药用辅料有限公司，批号170130）。复方丹参滴丸（天士力医药集团股份有限公司，批号190709）。BCA 蛋白浓度检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号20201010）；总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒（批号20201211）、总超氧化物歧酶（T-SOD）检测试剂盒（批号20210116）、还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（批号20200930）、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒（批号20200818）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（批号20200831）、过氧化氢（H2O2）检测测试盒（批号20210119）、NO 化学法检测试剂盒（批号20200808）均购自南京建成生物工程研究所。无水乙醇为分析纯。

1.2 仪器 YC-010 型多功能提取浓缩回收机组（上海雅程仪器设备有限公司）；HH-4 型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；DGZ-76型电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；CX-100 型快速开盖万能高速粉碎机（上海市晟喜制药机械有限公司）；TDP-1.5 型单冲压片机（上海绿翊机械制造有限公司）；SY-3D型片剂四用测定仪（上海黄海药检仪器有限公司）；AE260 型电子天平（万分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；JXFSTPRP-24 型全自动样品快速研磨仪（上海净信科技有限公司）；3K15 型低温离心机（德国Sigma 公司）；SpectraMax i3 型全自动荧光酶标仪（美国Molecular Devices 公司）。

1.3 动物 SPF 级雄性Balb／c 小鼠150只，体质量20～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2016-0006，使用许可证号SYCK（军）2020-0040，饲养于中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院动物实验中心，饲养室温度23～27 ℃，相对湿度45%～65%，维持饲料喂养，适应性喂养3 d 后开始实验，其间自由进食进水。

2 方法

2.1 制备工艺研究

2.1.1 浸膏粉制备 按处方比例称取红景天、黄芪、黄精、枸杞子，其中红景天、黄芪加14 倍量70%乙醇加热回流提取2次，每次138 min，滤过，药渣与药液分开备用；黄精、枸杞子与药渣合并，加入按比例称取的原处方饮片质量的10 倍量水煎煮提取3次，每次2.94 h，滤过，滤液备用，将醇提药液浓缩至无醇味后与水煎液合并，浓缩，制得浸膏，干燥，粉碎，过120 目筛，即得。

2.1.2 口含片制备 按配方称取“2.1.1”项下浸膏粉和辅料，过120 目筛，再加入一定比例甜味剂，混合均匀后加入一定体积分数乙醇，湿法制软材，过18 目筛制粒，在50 ℃下烘干，加入适量硬脂酸镁混匀压片，即得。

2.1.3 指标检测 根据实验目的，以口含片外观、口感、硬度、崩解时间为评价指标，四者权重分别为0.2、0.3、0.2、0.3［10-11］，采用综合加权评分法［12］评价处方中主要因素对口含片质量的影响。

2.1.3.1 外观 取本品10片，置于白色平盘中，在自然光下观察其完整度、色泽、表面光洁度，按表1 评分标准进行打分。

2.1.3.2 口感 征集15 名志愿者，采用盲法进行品尝，询问其感受，按表1 评分标准进行打分。

2.1.3.3 硬度测定 采用片剂硬度仪测定3～6 片本品的硬度，取平均值，按表1 评分标准进行打分。另外，不需要包衣的素片为了防止其在包装运输中出现松片裂片现象，硬度应不小于30 N。

2.1.3.4 崩解时间 按2020 年版《中国药典》四部通则0921 含片崩解时限检查法检查，要求不得在10 min 内全部崩解或溶解［13］，按表1 评分标准进行打分。

表1 各指标评分标准Tab.1 Scoring criteria for various indices

2.1.4 单因素试验

2.1.4.1 浸膏粉用量 考虑到片剂载药量不宜过低，故将浸膏粉比例控制在20% 以上；考虑到浸膏粉具有较强的吸湿性，而且还会影响口感，故其用量不宜超过50%。因此，将浸膏粉用量设置为25%、30%、35%、40%、45%，填充剂（乳糖-微晶纤维素）比例为3∶1，甜味剂（阿斯巴甜）用量为1%（以浸膏粉、填充剂总量计），润湿剂为70%乙醇，润滑剂为1% 硬脂酸镁（以干颗粒总量计）。

2.1.4.2 填充剂比例 将乳糖和微晶纤维素以一定比例混合，作为填充剂。固定浸膏粉用量为40%，则乳糖-微晶纤维素总量为60%，再将两者比例设置为4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2，甜味剂用量为1%，润湿剂为70% 乙醇，润滑剂为1%硬脂酸镁。

2.1.4.3 甜味剂用量 前期预实验发现，不同填充剂比例制得的片剂均存在明显涩味，故要加入适量矫味剂来改善口感。阿斯巴甜甜味纯正，不易吸湿，故将其作为甜味剂，用量设置为0、0.5%、1%、1.5%、2%。

2.1.4.4 润湿剂体积分数 选择乙醇作为润湿剂，将其体积分数设置为65%、70%、75%、80%、85%。

2.1.4.5 润滑剂用量 选择滑石粉、二氧化硅、硬脂酸镁作为润滑剂，将其用量分别设置为1%、1%、1%或0.5%。

2.1.5 正交试验 在单因素试验基础上，选择浸膏粉用量（A）、填充剂比例（B）、甜味剂用量（C）、润湿剂体积分数（D）作为影响因素，进行L9（34）正交试验，每组重复3次，因素水平见表2。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

2.2 耐缺氧作用研究

2.2.1 分组与给药 小鼠随机分为5组，分别为空白组、阳性组（复方丹参滴丸［14］）、复方红黄口含片低剂量组、复方红黄口含片中剂量组、复方红黄口含片高剂量组，每组30只，空白组灌胃给予0.5%CMC-Na 溶液，其他各组灌胃给予相应药物的0.5%CMC-Na 溶液。按照人用剂量折算，阳性组为0.15 g／kg，复方红黄口含片低剂量组为3 g／kg，复方红黄口含片中剂量组为5 g／kg，复方红黄口含片高剂量组为7.5 g／kg（复方红黄口含片各剂量组给药量按照片剂载药量换算，分别为人用剂量的10、20、30 倍），各组连续给药10 d，容量均为0.2 mL／10 g，每天1 次。

2.2.2 常压耐缺氧实验 各组小鼠于末次灌胃给药1 h后，放入装有5 g 钠石灰的250 mL 磨口瓶中，瓶中预先放1 张滤纸用于吸收排泄物。实验前，先在瓶口处均匀涂抹凡士林，放入小鼠后立即塞紧瓶盖以防止漏气，随后开始计时，以小鼠呼吸停止、腹部不起伏为观察指标，记录存活时间，计算其延长率。

2.2.3 亚硝酸钠中毒存活实验 各组小鼠于末次灌胃给药1 h后，腹腔注射2.4% 亚硝酸钠溶液，容量为0.1 mL／10 g，注射完成后立即开始计时，以呼吸停止、无明显活动特征为指标，记录存活时间。

2.2.4 急性脑缺血性缺氧实验 各组小鼠于末次灌胃给药1 h后，用锋利的手术剪自颈部逐只断头，记录断头后小鼠张口喘气次数。

2.2.5 氧化应激指标检测 取小鼠脑组织适量，按照相关试剂盒说明书检测T-AOC、T-SOD、GSH、CAT 活性及MDA、H2O2、NO 水平。

2.3 统计学分析 通过SPSS 25.0 软件进行处理，结果以（）表示，若数据符合正态分布，则多组间比较采用ANOVA 检验；若符合正态分布而且方差齐，则组间两两比较采用LSD 检验；若不符合方差齐性，则组间两两比较采用Games-Howell检验；若不符合正态分布而且方差不齐，则多组间比较采用独立样本Kruskal-Wallis 检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 单因素试验

3.1.1 浸膏粉用量 当浸膏粉用量增加时，硬度升高，崩解时间延长，但其本身的酸涩味会使口含片口感变差，并且崩解时间不宜过长，故确定为40%，见图1。

图1 浸膏粉用量对口含片质量的影响Fig.1 Effect of extract powder consumption on the quality of buccal tablets

3.1.2 填充剂比例 当乳糖与微晶纤维素比例为3∶1时，口含片外观、口感理想，硬度、崩解时间均符合药典要求，故确定为3∶1，见图2。

图2 填充剂比例对口含片质量的影响Fig.2 Effect of filler ratio on the quality of buccal tablets

3.1.3 甜味剂用量 当甜味剂用量为1%时，口含片外观、口感理想，硬度、崩解时间均符合药典要求，故确定为1%，见图3。

图3 甜味剂用量对口含片质量的影响Fig.3 Effect of sweetener consumption on the quality of buccal tablets

3.1.4 润湿剂体积分数 当乙醇体积分数过高时，颗粒太松散，不利于压片；过低时，浸膏粘手，也不利于制粒，故确定为75%，见图4。

图4 润湿剂体积分数对口含片质量的影响Fig.4 Effect of wetting agent concentration on the quality of buccal tablets

3.1.5 润滑剂用量 在相同用量下，加入二氧化硅、硬脂酸镁后颗粒流动性较好，但前者会使片剂发生脱盖现象，故不予考虑；后者为口含片常用润滑剂，但其本身为疏水性物质，又覆盖在颗粒表面，故用量过大时可能影响片剂水浸润性，造成其崩解或溶出迟缓，一般不宜超过1%，故确定为0.5%，见表3。

表3 润滑剂用量对口含片质量的影响Tab.3 Effect of lubricant consumption on the quality of buccal tablets

3.2 正交试验 结果见表4，方差分析见表5。由此可知，各因素影响程度依次为B＞A＞C＞D，即填充剂比例＞浸膏粉用量＞甜味剂用量＞润湿剂体积分数；因素A、B、C对口含片质量有显著影响（P＜0.05），而D无显著影响（P＞0.05），故参考文献［15-16］与验证试验结果，将D作为误差项。最终确定，最优工艺为A3B2C2D3，即浸膏粉用量40%，填充剂（乳糖-微晶纤维素）比例3∶1，甜味剂（阿斯巴甜）用量1.0%，润湿剂（乙醇）体积分数80%，润滑剂（硬脂酸镁）用量0.5%。

表4 试验设计与结果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

3.3 验证试验 按“3.2”项下优化工艺制备3批口含片，进行验证试验，结果见表6。由此可知，口含片崩解时间、硬度理想，口感良好，脆碎度、片重差异符合药典规定。

表6 验证试验结果（n＝3）Tab.6 Results of verification tests（n＝3）

3.4 耐缺氧作用

3.4.1 常压耐缺氧存活时间 与空白组比较，复方红黄口含片中、高剂量组小鼠存活时间延长（P＜0.05，P＜0.01），其中高剂量组长于阳性组，见表7。

表7 复方红黄口含片对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响（， n＝10）Tab.7 Effect of Compound Honghuang Buccal Tablets on mouse survival time under normal pressure（，n＝10）

表7 复方红黄口含片对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响（， n＝10）Tab.7 Effect of Compound Honghuang Buccal Tablets on mouse survival time under normal pressure（，n＝10）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4.2 亚硝酸钠中毒存活时间 注射亚硝酸钠后，各组小鼠存活时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表8。

表8 复方红黄口含片对小鼠亚硝酸钠中毒存活时间的影响（， n＝10）Tab.8 Effect of Compound Honghuang Buccal Tablets on mouse survival time poisoned by sodium nitrite（， n＝10）

表8 复方红黄口含片对小鼠亚硝酸钠中毒存活时间的影响（， n＝10）Tab.8 Effect of Compound Honghuang Buccal Tablets on mouse survival time poisoned by sodium nitrite（， n＝10）

3.4.3 张口喘气次数 与空白组比较，复方红黄口含片各剂量组小鼠张口喘气次数升高（P＜0.05，P＜0.01），见表9。

表9 复方红黄口含片对小鼠张口喘气次数的影响（，n＝10）Tab.9 Effect of Compound Honghuang Buccal Tablets on mouse mouth opening and wheezing frequency（， n＝10）

表9 复方红黄口含片对小鼠张口喘气次数的影响（，n＝10）Tab.9 Effect of Compound Honghuang Buccal Tablets on mouse mouth opening and wheezing frequency（， n＝10）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4.4 脑组织氧化应激指标 与空白组、阳性组比较，复方红黄口含片中、高剂量组小鼠脑组织T-SOD 活性升高（P＜0.05），各剂量组CAT 活性升高（P＜0.01）。各组小鼠脑组织GSH 活性及MDA、NO 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白组比较，复方红黄口含片低剂量组小鼠脑组织T-AOC 活性升高（P＜0.05）；与阳性组比较，复方红黄口含片各剂量组小鼠脑组织T-AOC 活性升高（P＜0.05，P＜0.01）。与空白组比较，复方红黄口含片高剂量组小鼠脑组织H2O2水平降低（P＜0.05）。见表10。

表10 复方红黄口含片对小鼠脑组织氧化应激指标的影响（， n＝10）Tab.10 Effects of Compound Honghuang Buccal Tablets on oxidative stress indices in mouse brain tissues（， n＝10）

表10 复方红黄口含片对小鼠脑组织氧化应激指标的影响（， n＝10）Tab.10 Effects of Compound Honghuang Buccal Tablets on oxidative stress indices in mouse brain tissues（， n＝10）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

4 讨论

中药片剂具有易吸湿的缺点，课题组前期选择乳糖-甘露醇作为填充剂，但不同比例两者制得的片剂都极易吸湿，故又考察了乳糖、甘露醇单独使用，但效果均不理想。查阅文献［17-18］发现，乳糖有甜味，吸湿性较低，为口含片常用辅料，增加其比例可提高片剂硬度，使其外观更完整光洁；微晶纤维素是天然纤维素的水解产物，性质稳定，与主药不发生化学反应，具有良好的流动性与可压性，可使颗粒松散均匀便于压片［19］。因此，本实验联合应用乳糖、微晶纤维素作为复方红黄口含片填充剂，并优选出两者最佳比例为3∶1。

口含片中浸膏粉比例只占40%，耐缺氧实验若直接以其给药则剂量难以准确控制，而且用量较大。因此，本实验直接采用浸膏粉，并参考市面上其他口含片用量，将低、中、高剂量分别换算成人体质量的10、20、30倍，发现不同剂量给药后小鼠进食饮水正常，无不良反应出现，表明复方红黄口含片安全范围较宽。

缺氧后脑组织能量转化不足，活性氧、有害氮氧自由基增多，可攻击细胞而引起氧化应激［20］。T-SOD、GSH、CAT、T-AOC 是重要的抗氧化物酶［21］，本实验发现，给药后四者水平升高，表明复方红黄口含片可调节机体在缺氧时氧化-抗氧化平衡。MDA、H2O2、NO 是氮氧自由基有害代谢产物，可反映细胞受损程度，本实验发现，给药后三者水平均有不同程度的降低，表明复方红黄口含片可减缓缺氧时细胞和组织受到的损伤。