石菖蒲中乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选

方 洪，韩沅沅，谷丽华*，李林楠，杨 莉，吴其国，王峥涛

(1.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，国家中医药管理局中药新资源与质量评价重点实验室，上海 201203；2.上海中药标准化研究中心，上海 201203)

乙酰胆碱(ACh)是中枢胆碱能系统中重要的神经递质之一，其主要功能是维持意识的清醒，在学习记忆中起到重要作用，可被丝氨酸水解酶乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)水解为乙酸和胆碱，终止兴奋刺激作用，保证神经信号分子在体内的正常传导[1]。乙酰胆碱脂酶抑制剂(acetylcholinesterase inhibitor，AChEI)能对乙酰胆碱脂酶进行可逆性抑制，以减少突触间隙乙酰胆碱的降解，达到乙酰胆碱在突触处的积累，延长并增加乙酰胆碱的可利用性，在临床可用于阿尔兹海默症、重症肌无力及青光眼的治疗[2-3]。目前用于治疗阿尔茨海默症的药物，有四种为乙酰胆碱脂酶抑制剂，如他克林、利斯的明、多奈哌齐和加兰他敏，一定程度上对临床症状有缓解作用，但也存在选择性低、毒副作用大等不足[4]。

中药在治疗阿尔茨海默症及新药开发方面发挥着重要作用。近年来，很多天然产物被报道具有乙酰胆碱酯酶抑制作用，如石杉碱甲、加兰他敏、石蒜碱等，在阿尔茨海默症等疾病的治疗中具有巨大的开发潜力[5]。中药石菖蒲是天南星科植物石菖蒲AcorustatarinowiiSchott干燥根茎，性辛、苦、温，归心、胃经，具有开窍豁痰，醒神益智，化湿开胃之功，临床上用于治疗神昏癫痫，健忘失眠，耳鸣耳聋[6-7]。有学者总结中药治疗阿尔茨海默症的用药规律，发现传统用于治疗老年痴呆的中药复方中石菖蒲使用频率最高[8]。含石菖蒲的传统方剂开心散、远志散和益气聪明汤，具有治好忘，补益心脾、化痰开窍、益智定志的功效，现代研究也表明这些制剂有改善痴呆模型动物的空间学习能力和记忆再现能力[9-11]，与石菖蒲的传统功效相一致。

高效薄层色谱 (HPTLC) 是一种分离效率高、成本低、样品用量少、应用广泛的微量分析技术。薄层色谱-生物自显影技术(thin-layer chromatography bioautography)是应用薄层层析和生物活性检定于一体的活性物质筛选方法，该方法操作简单、耗费低、灵敏度和专属性强，用于胆碱酯酶抑制剂、抗氧化剂、脂肪酶抑制剂和糖苷酶抑制剂的筛选[12-15]。质谱 (MS) 是一种灵敏度高、选择性好、可进行定性分析的现代仪器。薄层色谱-质谱技术的联用，可实现优势互补，为复杂样品中目标化学成分的结构鉴定提供一条有效的途径[16]。分子对接是利用算法预测受体和配体的复合构象及其结合亲和力，近年来已被广泛用于筛选药物分子和验证药物活性[17-18]。本研究以石菖蒲为研究对象，采用薄层色谱-生物自显影联合质谱技术筛选和鉴定石菖蒲中抗乙酰胆碱酯酶活性成分，并结合分子对接技术，验证和评价所筛选成分的活性效能，为石菖蒲防治阿尔茨海默症等疾病的进一步研究以及临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与药物 乙酰胆碱酯酶(AChE，批号1002932438)、固蓝B盐(批号1002072823)(美国Sigma 公司)；乙酸-α-萘酯(上海化成工业发展有限公司，批号A0037)；牛血清白蛋白(BSA，上海蓝季科技发展公司，批号110913)；加兰他敏(中国食品药品检定研究院，批号10050-200802)。石菖蒲产地云南昭通(批号2018071501)，经上海中医药大学中药研究所吴立宏研究员鉴定为天南星科植物石菖蒲AcorustatarinowiiSchott干燥根茎。硅胶预制板(烟台市化学工业研究所，批号20200919)；硅胶GF254预制薄层板(TLC Silica gel 60 F254，德国Merck公司，批号HX01557929)；固相萃取小柱(批号043639275A，美国Waters公司)。甲醇、乙腈为色谱纯(美国Fisher Chemical公司)；甲苯、甲醇、乙酸乙酯为分析纯(上海国药集团化学试剂有限公司)；水为超纯水。

1.2 仪器 薄层色谱自动点样仪、薄层色谱成像仪、薄层色谱自动展开仪、双槽展开缸、薄层色谱质谱接口仪(瑞士CAMAG公司)；超声波清洗器(美国Branson公司)；SC-15恒温水浴槽(上海比朗仪器有限公司)；Milli-Q Synthesis A10(美国Millipore公司)；BT25S型电子分析天平(德国赛多利斯公司)；超高效液相色谱仪-线性离子阱质谱(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 阳性对照溶液、试剂溶液制备 精密称取阳性对照药(加兰他敏)5 mg，甲醇制成每1 mL含1 mg该成分的阳性对照溶液。取乙酰胆碱酯酶(50 U/mL)1 mL，溶于50 mL Tris-HCl 缓冲液(20 mmol/L，pH 7.8)中，加入50 mg牛血清白蛋白(BSA)[19]，制成酶溶液。精密称取乙酸-α-萘酯75 mg，置于50 mL量瓶中，50 mL无水乙醇溶解，制成1.5 mg/mL底物溶液。精密称取固蓝B盐50 mg，置于50 mL量瓶中，蒸馏水溶解并定容，制成1 mg/mL显色剂溶液。

1.4 样品溶液制备及挥发油提取 取药材粉末10 g，置于100 mL圆底烧瓶中，加入50 mL甲醇，加热回流2 h，取1 mL滤液，作为样品溶液I；其余滤液蒸干，残渣加2 mL水复溶，转移至经甲醇活化、水平衡后的固相萃取小柱(SPE-C18，5 g)中，依次用50 mL水、10%甲醇、20%～90%甲醇、甲醇洗脱，共收集11份洗脱液，分别减压浓缩，残渣加1 mL洗脱液溶解，滤过，作为样品溶液Ⅱ～Ⅻ。

按照2020年版《中国药典》一部挥发油测定法(通则2204乙法)，取药材粉末10 g，加入300 mL水，置于挥发油测定器中，加入二甲苯1 mL，连接回流冷凝管，加热保持微沸5 h，停止加热，放置15 min，取二甲苯层，甲醇稀释5倍，作为挥发油溶液XⅢ。

1.5 薄层色谱分析 采用自动点样仪，将样品溶液I～XⅢ(5.0 μL/条带)点于高效硅胶预制薄层板上，条带宽度为8 mm，条带间距为11.4 mm，置于双槽展开缸(20 cm×10 cm)中展开，展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲醇(10∶1∶0.2)，展距8.5 cm，平行展开制备3份薄层板，第1块薄层板用10%硫酸乙醇显色后，在紫外光灯(365 nm)下检视；第2块用生物自显影法显色后进行生物活性检测，第3块直接用于质谱分析。

1.6 生物自显影分析 根据文献[19]报道的方法，并作适当调整。将点样展开后的薄层板浸入乙酸-α-萘酯溶液，取出，冷风快速吹至薄层板无乙醇味，浸入乙酰胆碱酯酶溶液中，取出，置于37 ℃恒温水浴锅中孵育20 min，取出，浸入固蓝B盐溶液中，取出，观察白色活性斑点；取阳性对照溶液，同法平行操作，将薄层板置薄层色谱成像仪上检视、拍照。

1.7 质谱分析 在活性条带对应的位置上用铅笔在未显色薄层板表面作好标记，将标记部位置于TLC-MS接口处，由UHPLC色谱仪直接洗脱并泵入电喷雾线性离子阱质谱(LTQ-ESI-MS)仪进行分析，洗脱剂为水-乙腈混合物(5∶95)；体积流量0.3 mL/min。质谱仪由Xcalibur软件控制。主要工作参数设定为离子源加热温度300 ℃；毛细管温度350 ℃；喷雾电压3.5 kV；毛细管电压10 V；采用全扫描模式，m/z100～1 000；采集时间0.2～0.5 min。

1.8 分子对接 从RCSB蛋白数据库(RCSB PDB，http://www.rcsb.org/)下载人源乙酰胆碱酯酶(AChE)结构(PDB ID为4EY6)，该蛋白原配体为乙酰胆碱酯酶抑制剂加兰他敏[20]，选择A链作为受体进行对接，将其导入PyMOL软件，进行结构优化后保存为pdb格式，再导入Auto Dock Tools 1.5.6[21]优化后保存为pdbqt格式。从有机小分子生物活性数据库(PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载目标化学成分的3D结构，将其导入Chem 3D 19.0，采用MM2力场进行能量最小化操作后保存为mol 2格式，再导入Auto Dock Tools 1.5.6优化后保存为pdbqt格式。在Auto Dock Tools 1.5.6中运行Auto Grid，以center x=-2.827，center y=-40.098，center z=30.802为中心，构建64×64×64的盒子，采用Auto Dock Vina 1.1.2进行对接，导出结合能最低的构象，Discovery Studio 2016对结果进行可视化分析。

2 结果

2.1 薄层鉴别 本实验考察了石油醚、乙酸乙酯、甲醇、75%甲醇，发现甲醇提取率最高，白色活性斑点最清晰，故选择其作为提取溶剂。以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(10∶1∶0.2)为展开剂时分离度最好，高效默克硅胶预制薄层板的质谱信号最佳。甲醇提取溶液I的薄层图中有3个活性条带(Rf分别为0.57、0.45、0.23)，分别作为斑点1、2、3(图1A)，10%硫酸乙醇显色，在紫外灯下观察。甲醇提取物梯度固相萃取后对成分进行分段富集(图1B、1C)，采用挥发油提取法提取挥发油，寻找活性成分，结果见图1C。固相萃取共获得11个洗脱段，活性部位主要集中在50～90%部分(Ⅶ～Ⅺ)，图1C显示，在50～60%有活性斑点1，同时发现1个新的活性斑点，记为斑点4；70%段有活性斑点2，同时发现活性斑点5；90%段含有活性斑点3；挥发油中含有活性斑点1、3，未发现新的活性斑点。

注：S为加兰他敏。A、C分别用10%硫酸乙醇溶液显色(365 nm)、生物自显影试剂显色(可见光)，B为部分分段组分的生物自显影试剂显色图。图1 石菖蒲提取液薄层色谱-生物自显影图谱Fig.1 TLC-bioautographic chromatograms of A. tatarinowii root extract

2.2 质谱分析 图2、表1显示。斑点1在ESI+模式下m/z231.08[M+Na]+、209.17[M+H]+，二级质谱m/z216[M+Na-15]+，结合分子质量、与文献[22]、对照品比对，鉴定为β-细辛醚；斑点2在ESI+模式下m/z277.25[M+Na]+，二级质谱m/z259.25[M+Na]+，文献中未查到相应成分；斑点3在ESI-模式下m/z279.33[M-H]-、281.33[M+H]+，二级质谱m/z261.33[M-H-H2O]-，结合分子质量及与对照品对比推测为亚油酸[22]；斑点4在ESI+模式下m/z 235.25[M+H]+，二级质谱m/z217.170 8[M+H-H2O]+，结合分子质量及与文献[23]推测为菖蒲螺酮烯；斑点5在ESI+模式下m/z241.25[M+Na]+、219.33[M+H]+，二级质谱m/z209.08[M+Na-OCH3]+，结合分子质量及与文献[24]比对推测为桔利酮。

图2 5个活性斑点质谱图及其结构Fig.2 MS spectra and structures of five active zones

表1 5个活性斑点MS鉴定结果Tab.1 Results of MS identification of five active zones

2.3 分子对接 结合能≤-1.2 kcal/mol时小分子与蛋白可以自由结合，≤-5.0 kcal/mol时小分子与蛋白相互作用较强，≤-7.0 kcal/mol时视为小分子与蛋白相互作用强烈，结合能越低相互作用越强[25]。表2显示，β-细辛醚、α-细辛醚、亚油酸、桔利酮、菖蒲螺酮烯与AChE的结合能均小于-5.0 kcal/mol，表明它们与AChE相互作用均较强，验证生物自显影实验结果，亲和能力由强到弱依次为菖蒲螺酮烯、桔利酮、α-细辛醚、亚油酸、β细辛醚。

将表2结果导入Discovery Studio 2016软件进行可视化分析，结果见图3。由此可知，AChE与各活性成分产生作用的重要氨基酸残基为TRP86、TYR337、PHE338、TYR124和HIS447，其次为TYR72、GLY121、SER23、TYR341，主要表现为氢键作用和疏水作用。

表2 分子对接的结合自由能Tab.2 Binding free energy of molecular docking

图3 活性成分与AChE受体对接模式图Fig.3 Docking mode profiles for active constituents and AChE receptor

3 讨论

石菖蒲作为一味传统中药，具有保护神经元、提高记忆认知功能，在临床主要用于治疗和改善神经系统疾病[26]。文献对含量较高的β-细辛醚和α-细辛醚乙酰胆碱酯酶抑制活性多有报道，但对石菖蒲中其他成分研究较少，可能是因为其他成分含量较低，对分离、筛选及相关分析形成一定难度。本文通过高效薄层色谱-生物自显影法对石菖蒲中乙酰胆碱酯酶抑制成分进行了系统筛选，发现甲醇提取物通过SPE固相萃取小柱后的50%～90%甲醇洗脱段富含活性成分，进一步展开分析发现包括β-细辛醚在内的5个活性斑点，通过质谱的一级和二级碎片分析，结合文献数据，其中4个活性斑点经鉴定可能为β-细辛醚(与α-细辛醚重合)、亚油酸、桔利酮和菖蒲螺酮烯，并用β-细辛醚、α-细辛醚和亚油酸对照品验证了鉴定结果；另一个m/z277.25[M+Na]+的活性斑点，未获得鉴定。将5个鉴定的活性成分分子结构与AChE蛋白进行分子对接，以结合能低于-5.0 kcal/mol为标准进行验证，结果发现，5个活性成分均与AChE受体有较好的结合性，可能主要是通过TRP86、TRP337和PHE338等氨基酸与乙酰胆碱酯酶产生氢键作用或疏水作用。

β-细辛醚和α-细辛醚是石菖蒲挥发油中的主要成分，有文献报道细辛醚类是石菖蒲益智作用的药效物质，并认为其作用机理可能是小分子能够顺利通过血脑屏障进入大脑，抑制脑内乙酰胆碱酯酶活力、诱导c-jun基因表达等改善学习记忆功能[27-28]；另有研究显示体内长链不饱和脂肪酸的缺少与AD发病有密切关系，长期适量服用长链不饱和脂肪酸亚油酸具有预防AD的作用，亚油酸具有乙酰胆碱酯酶活性(IC50值为18.17±1.86 mg/mL)[29-30]。β-细辛醚和α-细辛醚虽然含量高，且具有乙酰胆碱酯酶抑制活性，但有报道具有急性毒性和致突变作用[31]，从而限制了临床应用，本次研究发现石菖蒲中菖蒲螺酮烯和桔利酮结构与乙酰胆碱酯酶的结合能明显低于β-细辛醚和α-细辛醚，具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制作用，尚未见相关文献报道，值得深入研究，对石菖蒲安全有效的临床应用和新药开发具有重要意义。