薄层色谱法的操作要点及影响因素

李 杨 姜慧莹 陈嘉兴 杨 爽 黄 帅（吉林职业技术学院延边133400）

薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的标准物质按同法所得的色谱图对比[1，2]。薄层色谱法的操作分别是供试品溶液的制备、对照品或对照药材溶液的制备、选择吸附剂、点样、展开、显色与检视。

1 实验方法

1.1 供试品溶液的制备：根据选取的目标成分选用适宜的提取方法和提取溶剂，常用的提取方法包括浸泡、振摇、超声等法、加热回流等。提取的目标成分沸点较低，在提取时应注意不可加热提取，应超声或振摇浸泡提取，制备时不应受热，在鉴别牡丹皮时，由于丹皮酚沸点为31℃，高温蒸干后，丹皮酚易挥发，高温挥干和室温挥干的薄层色谱图。如图1所示。

1.2 选择吸附剂：预制薄层板按固定相种类分为硅胶薄层板、键合硅胶板、微晶纤维素薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等。固定相中可加入黏合剂、荧光剂。硅胶薄层板常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H 、硅胶HF254、G、H 表示含或不含石膏黏合剂。F254为在紫外光254 nm波长下显绿色背景的荧光剂。按固定相粒径大小分为普通薄层板（10～4 μm）和髙效薄层板（5～10 μm）。自制的薄层板。固定相颗粒大小一般要求粒径为10～40 pm。玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。黏合剂通常为羧甲基纤维素钠，配制时应均匀散落在水的表面，自然沉降，固定相与黏合剂通常为1∶3，混合后，沿一个方向研磨排除气泡。稠度以用研棒黏取呈连珠状而不呈线状下滴为好[2]。薄层板铺制完成后，置110℃下干燥30 min[3，4]。

在黏合剂加入适量的氢氧化钠，铺制的薄层板，在分离一些酸性成分时要优于硅胶G薄层板的分离效果，例如丹参的薄层色谱鉴别，分别选用硅胶G薄层板和碱板，同一条件下，碱板的分离效果较好，如图2所示。

1.3 点样：一般采用微升毛细管点样，也可用自动点样器。在薄层板点样的斑点一般呈圆点状或窄细的条带状，根据特征斑点在薄层色谱显现的效果，选择点样方式。例如，黄芪的薄层色谱，在点样的斑点呈圆点状时，薄层色谱背景较深，可以选择条带状点样，使薄层色谱的背景拉伸变浅，特征斑点清晰，薄层色谱如图3。

1.4 展开：展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭，一般保持15～30 min。溶剂蒸气预平衡后，应迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭，展开。如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则须在展开缸的内壁贴与展开缸高、宽同样大小的滤纸，一端浸入展开剂，密闭一定时间，使溶剂蒸气达到饱和再如法展开。如薄层色谱在分离生物碱时，需要在置氨蒸气饱和的展开环境中展开，例如黄连的薄层色谱鉴别，未用浓氨溶液饱和的展开环境或氨蒸汽的浓度低都会导致薄层色谱的Rf值降低或主斑点不清晰，见图4。

1.5 显色与检视：有颜色的物质可在可见光下直接检视，无色物质可用喷雾法或浸溃法以适宜的显色剂显色，或加热显色，在可见光下检视。有荧光的物质或显色后可激发产生荧光的物质可在紫外光灯（365 nm或254 nm）下观察荧光斑点。对于在紫外光下有吸收的成分，可用带有荧光剂的薄层板（如硅胶GF254板），在紫外光灯（254 nm）下观察荧光板面上的荧光物质淬灭形成的斑点。厚朴的薄层色谱鉴别，薄层色谱在经过碘蒸气氧化后，在紫外254 nm下检视，其特征斑点相比于未经碘蒸气氧化更加清晰，如图5。

2 结果与讨论

薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层上，在展开容器内用展开剂展开，供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的标准物质按同法所得的色谱图对比[1]，广泛用于鉴别、检査。其操作步骤中，影响因素较多，本研究于各操作步骤中选取实际应用的影响因素，讨论薄层色谱在应用时的技术难点[5]。供试品溶液制备时需注意目标成分的熔沸点，以此作为依据进行供试品的制备。吸附剂的选择要根据所分离的某一类目标成分来选择，中药复方制剂成分复杂，为薄层色谱检测带来许多困难，依据目标成分性质选择适宜的吸附剂对于薄层色谱的分离存在较大影响。薄层色谱多用圆点点样，条形点样应用较少，对于皂苷分离效果不好的成分可以采用条形点样的方式，使目标成分的特征斑点在分离条带中剥离得更加清晰。薄层色谱展开操作中，氨水预饱和可以用于皂苷、生物碱的分离，根据成分间的相似相溶原理，薄层色谱目标成分斑点更加清晰，分离度较高。薄层色谱法检视主要分为三种方式，日光检视、紫外365 nm检视、紫外254 nm检视，可以根据特征成分的特性选择适宜的氧化还原显色剂，使检视斑点更加清晰。