极度低氧条件下基质细胞衍生因子-1α 过表达对间充质干细胞迁移的影响

王 辉 徐亮亮 孙大明 孟 一 张成龙 许海甲 宁 宇 李章华

1.武汉大学同仁医院骨科，湖北武汉 430000；2.武汉体育学院研究生院，湖北武汉 430000；3.湖北省襄阳市中医医院骨科，湖北襄阳 441000

目前临床研究表明，组织坏死常伴有缺血缺氧环境形成，如缺血性股骨头坏死局部氧分压可降至1%～2%，甚至无氧，导致骨再生效果降低[1-3]。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因有多向分化潜能，而在细胞移植方面备受关注。本课题组前期实验证实，静脉移植的MSCs 可向股骨头坏死区迁移、存活及增殖[4]。但此种方法需要大量纯度高、活性强的MSCs，且需要多次移植，这些或与局部低氧、趋化因子表达不足有关。因此，提高MSCs 归巢能力、增加局部MSCs 数量逐渐成为研究的方向。基质细胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）是趋化因子CXC 亚家族的一员，主要通过与其受体4（CXC subfamily receptor 4，CXCR4）结合促进细胞迁移[5-8]。研究表明，低氧环境会导致缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）分解受阻而发生富集，富集的HIF-1α 进而激活下游SDF-1α 蛋白，提高CXCR4 的表达并促进细胞迁移[9-10]。Wang 等[11]发现，SDF-1 和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达水平更高的M2 型巨噬细胞比M1 型巨噬细胞对骨髓源性细胞的募集作用更强，且能新生更多血管。之前，本课题组证实在常氧环境下，过表达SDF-1α 可通过HIF-1α/VEGF/SDF-1α/CXCR4 信号轴促进MSCs 迁移[12]，但该研究主要在常氧下进行，目前临床在极度低氧条件下进行的研究尚不多见。因此，本研究旨在观察极度低氧条件下SDF-1α 过表达对MSCs 迁移的影响，为改善MSCs 体内移植提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

MSCM 培养基（Sciencell，美国，7501）；RNA 提取试剂盒（OMEGA，美国，R693401）；逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR 试剂盒（TOYOBO，日本，QPK-201）；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Lipofectamin TM 2000（Invitrogen，美国，2145903）；AMD3100（Sigma，德国，A5602）；Transwell 小室（Corning，美国，35022254）；SDF-1α腺病毒（SDF-1α adenovirus，Ad-SDF-1α）由吉凯基因（上海）有限公司制作；HIF-1α 单克隆抗体（abcam，美国，179483）；VEGF单克隆抗体（碧云天，中国，AF0312）；CXCR4 单克隆抗体（NOVUS，美国，10074396）；CO2培养箱（Thermo Fisher，美国，311）；实时荧光定量PCR 仪器（BIORAD，美国，788BR06733）；荧光倒置显微镜（Leica，德国，D35578）；酶标仪（Molecular，美国，301-2431241）。

1.2 实验方法

1.2.1 MSCs 培养及转染 普通级雄性日本大耳白兔两只，两周龄，体重（250±30）g，合格证号：420100000053 84，由武汉市万千佳兴生物科技有限公司提供[SCXK（鄂）2016-0011]，独笼饲养，自由饮水，温度控制在（25±1）℃，湿度控制在40%～70%，每日观察其生活及精神状态，定期打扫卫生，保持饲养环境清洁。所有动物实验均遵循实验动物护理和使用指南，所有动物实验均在武汉大学同仁医院进行，均经武汉大学同仁医院伦理委员会批准（伦理批号：SY2019-025）。

按课题组前期方法分离、培养MSCs[13]。将第三代MSCs 计数后以2×105/孔密度接种于6 孔板，分为四组：①空白组，不进行干预；②AMD3100 组，加入CXCR4特异性抑制剂AMD3100 并使其终浓度为60 μmol/L；③Ad-SDF-1α 组，将Ad-SDF-1α 溶于无血清培养基后以感染复数为60 MOI 对MSCs 进行转染，转染6 h后，将无血清培养基更换为MSCM 培养基；④Ad-SDF-1α+AMD3100 组，将Ad-SDF-1α 溶于无血清培养基后以感染复数为60 MOI 对MSCs 进行转染，同时加入AMD3100。各组均在37℃、5% CO2、1% O2环境中培养48 h，然后观察细胞状态，同时记录腺病毒转染效果。

1.2.2 Transwell 实验 将四组细胞采用1×PBS 洗涤两遍并用无血清L-DMEM 培养基稀释至浓度1×105/ml，每组细胞取200 μl 加入Transwell 板的上室，用无血清培养基稀释SDF-1α 蛋白，使其终浓度为100 μg/L，取500 μl 加入下室。在37℃、5% CO2、1% O2环境中孵育12 h，擦去上室中未迁移的MSCs，1×PBS 润洗两遍后多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色10 min，1×PBS洗去结晶紫，显微镜下观察并记录迁移的MSCs，用400 μl 33%冰醋酸溶解结晶紫，选择565 nm 波长，酶标仪下检测光密度（optical density，OD）值。每组3个复孔。

1.2.3 实时荧光定量PCR 检测迁移信号轴HIF-1α、VEGF、CXCR4 mRNA 表达 四组细胞培养完成后，1×PBS洗涤两遍，根据RNA 提取试剂盒说明书提取总mRNA，各取1 μg mRNA 进行逆转录获取cDNA。引物设计，按照NCBI GENE 查HIF-1α、VEGF、CXCR4 及GAPDH 基因序列，引物序列见表1。PCR 体系各组分SYBR MIX、上下游引物混合液及cDNA 分别为10、1、1 μl，加入DEPC 水补至20 μl，以GAPDH 为内参。反应程序为95℃预变性60 s，95℃变性15 s，72℃退火15 s 及60℃延伸15 s，共40 个循环，以2-ΔΔCt法得出mRNA 表达量。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot 检测迁移信号轴HIF-1α、VEGF、CXCR4 蛋白表达 四组细胞培养完成后，1×PBS洗涤两遍，加入RIPA 蛋白裂解液，冰上裂解30 min，蛋白浓度用BCA 法定量，将蛋白与上样缓冲液以4∶1比例混合，100℃煮5 min，SDS-PAGE 电泳后200 mA恒流电转膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h。分别加入GAPDH 及HIF-1α、VEGF、CXCR4单克隆抗体，以GAPDH 为内参，4℃摇床孵育过夜。TBST 洗膜后用二抗室温孵育1 h，再次洗膜后加入显影剂，在Biorad化学发光系统显影。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验，多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSCs 形态及Ad-SDF-1α 转染效果观察

MSCs 贴壁后为梭形、多角形，呈克隆式生长，Ad-SDF-1α 转染后可观察到均一且明亮的绿色荧光。见图1。

图1 间充质干细胞形态及基质细胞衍生因子-1α 腺病毒转染效果

2.2 四组迁移情况比较

AMD3100 组OD 值低于空白组，Ad-SDF-1α 组OD 值高于空白组，Ad-SDF-1α+AMD3100 组OD 值高于AMD3100 组且低于Ad-SDF-1α 组，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。见图2。

图2 四组迁移情况比较（n=3）

2.3 四组HIF-1α、VEGF、CXCR4 mRNA 表达比较

AMD3100 组VEGF、CXCR4 mRNA的表达低于空白组，Ad-SDF-1α 组HIF-1α、VEGF、CXCR4 mRNA表达均高于空白组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。Ad-SDF-1α+AMD3100 组VEGF、CXCR4 mRNA表达均高于AMD3100 组，HIF-1α、VEGF、CXCR4 mRNA 表达均低于Ad-SDF-1α 组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见图3。

图3 四组HIF-1α、VEGF、CXCR4 mRNA 表达比较（n=3）

2.4 四组HIF-1α、VEGF、CXCR4 蛋白表达比较

AMD3100 组HIF-1α、VEGF、CXCR4 蛋白表达低于空白组，Ad-SDF-1α 组HIF-1α、VEGF、CXCR4 蛋白表达均高于空白组，差异有统计学意义，Ad-SDF-1α+AMD3100 组HIF-1α、VEGF、CXCR4 蛋白表达均高于AMD3100 组且均低于Ad-SDF-1α 组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见图4。

图4 四组HIF-1α、VEGF、CXCR4 蛋白表达比较（n=3）

3 讨论

HIF-1α/VEGF/SDF-1α/CXCR4 轴对调节细胞迁移具有重要作用。HIF-1 是启动基因，由HIF-1α 和HIF-1β 两个亚基构成，其中HIF-1α 是目前已知最重要的缺氧受体和缺氧诱导转录因子，HIF-1α 被激活后可以增加细胞在缺氧环境中生存能力，维持氧的内环境平衡，使机体适应缺氧，进而促进细胞黏附、迁移和血管生成[14-17]。当其被敲除或抑制后，细胞的迁移明显被抑制，SDF-1α 和CXCR4 的mRNA 和蛋白水平也显著降低[18]。研究发现，HIF-1α 并不是直接作用于细胞，当组织或器官缺氧时，HIF-1α 会与HIF-1β结合，并易位到细胞核中，与VEGF 基因5’侧翼区域的特定序列结合，激活VEGF，促进血管形成[19-21]。VEGF 是一种约40 kD 的二聚糖蛋白，作为一种高效的内皮细胞有丝分裂原，可刺激增殖、迁移和导管形成[22-23]。如Hong 等[24]研究VEGF 对肿瘤细胞的直接作用时发现，VEGF 除了可促进肿瘤细胞形成血管外，还可上调肿瘤细胞SDF-1α 及CXCR4 的表达，进而促进细胞转移。Lima 等[25]的研究也认为VEGF 可招募CXCR4 阳性细胞。VEGF 激活SDF-1α 后，SDF-1α 可诱导CXCR4 从细胞内部转移到细胞表面并与之结合，进而激活下游信号促进细胞迁移[26-27]。研究发现，SDF-1 及其受体CXCR4 与VEGF 的作用是相互的，在组织缺血缺氧区，SDF-1/CXCR4 可刺激VEGF 的表达进而促进血管形成[28-29]。这些研究阐明了SDF-1对细胞迁移的重要性及基本作用原理。

MSCs 移植入体内时，决定治疗效果的关键在于MSCs 向损伤或坏死区域定向归巢的数量及活性的维持[30]。目前，对低氧环境下MSCs 分化能力的意见尚不统一。有研究认为低氧环境可抑制MSCs 成骨活性，下调成骨因子表达[31-32]。也有研究发现，低氧利于MSCs成骨分化，随着缺氧时间进展，MSCs 中骨桥蛋白、骨钙素及碱性磷酸酶的表达增加，并上调ColⅠ、Ⅲ表达，从而提高MSCs 成骨效应[33-34]。因此增强低氧环境下MSCs 归巢能力，提高归巢数量就显得很有必要。基于此目的，本研究将前期构建的SDF-1α 腺病毒[35]转染入MSCs，建立过表达SDF-1α 细胞体系，并将MSCs置于极度低氧环境培养以观察其迁移能力变化。Transwell 实验结果显示，Ad-SDF-1α 组MSCs 迁移数目最多，AMD3100 组最少，Ad-SDF-1α 与AMD3100共同转染相对于AMD3100 组有所提高，提示极度低氧条件下SDF-1α 过表达可促进MSCs 迁移，并在一定程度上逆转AMD3100 的抑制效应。另外，本研究在基因层面对迁移信号轴HIF-1α、VEGF、CXCR4 进行了检测，结果显示SDF-1α 过表达不仅可上调其受体CXCR4 表达，同时可上调HIF-1α、VEGF 表达，提示SDF-1α 与HIF-1α 及VEGF 之间存在相互作用，共同促进MSCs 的迁移，这与本课题组前期常氧下研究结果相符[12]。

综上所述，本研究提示，在极度低氧条件下SDF-1α 过表达仍然具有促进MSCs 迁移的能力，为优化MSCs 体外移植提供参考。后续实验中，本课题组将通过体内实验及示踪技术，观察SDF-1α 过表达后MSCs 的治疗效果及其对循环中MSCs 的影响。