基于网络药理学分析绞股蓝治疗骨质疏松症的机制研究

甄瑞峰 卢文君 刘树娇

桂林医学院附属医院全科医疗科，广西桂林 541001

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种骨量低、骨组织微结构损坏，骨脆性增加，易发生骨折的全身性骨病。有调查报告显示，我国OP 的患病率在50 岁以上人群为19.2%，其中男性为6.0%，女性为32.1%；65岁以上人群达到了32.0%，其中男性为10.7%，女性为51.6%。OP 发病形势严峻，给社会、家庭带来了沉重的负担。

近年来，有众多学者研究传统医药治疗OP 的疗效，进一步证明了中医在OP 治疗过程中的积极作用。绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum （Thunb.）Makino.]别名七叶胆、百味莲，属于葫芦科、绞股蓝属草质攀援植物，以根状茎入药，有消炎退肿、活血祛风、降压等功效。在中国、日本、朝鲜、东南亚等多地均有分布。绞股蓝中含有类黄酮、皂苷、无机元素等，其提取物在治疗动脉粥样硬化、抑制肿瘤生长、抗抑郁方面有一定的疗效。而近年的多项动物实验证实，绞股蓝的提取物在促进成骨细胞增殖、分化方面有一定的作用。本研究运用网络药理学的研究方法，探讨绞股蓝治疗OP 的潜在有效成分及相关机制，为OP 的治疗提供理论依据。

1 方法

1.1 获取及筛选有效活性成分及其靶点

以“绞股蓝”为关键词，在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems phar macology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）进行检索，获得其化学成分，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性指数（drug like index，DL）≥0.18 为标准设定筛选条件。

使用Perl 软件，对TCMSP 获取的绞股蓝所有成分所对应的靶点进行筛选，获得绞股蓝有效活性成分所对应的作用靶点。将有效活性成分对应的作用靶点利用UniProt（https//www.uniprot.org/）进行标准化处理，限定物种设定为“human（人）”，得到绞股蓝有效活性成分的潜在靶点，将重复靶点和非标准靶点剔除，获取有效活性成分所匹配的靶点库。使用网络可视化软件Cytoscape3.8.2 构建有效活性成分-靶点网络。

1.2 OP 作用靶点获取

将“Osteoporosis”作为关键词输入Genecards（https://www.genecards.org/）、 药物靶标数据库（Therapeutic Target Database，TTD，db.idrblab.net/ttd）, 在线孟德尔人类遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://www.omim.org/） 和药物遗传学与药物基因组学知识库（Pharmacogenomics Knowledgebase，PharmGKB，https://www.pharmgkb.org）等数据库中进行检索，获取OP 相关作用靶点。使用R 4.1.1 软件合并4 个数据库交集靶点。

1.3 绞股蓝有效活性成分作用靶点与疾病靶点交集的获取及构建网络关系图

使用R 4.1.1 软件将绞股蓝有效活性成分作用靶点和OP 作用靶点进行匹配，取交集靶点，并制作维恩图。使用Cytoscape 3.8.2 软件，构建绞股蓝有效活性成分与交集靶点的网络。

在该网络中，节点代表绞股蓝有效活性成分及其作用于疾病的靶点。边代表活性成分-靶点的相互作用。节点的度值越大，越表示该节点在网络中的作用越关键。

1.4 共同靶点的获取和蛋白相互作用网络的构建

使用R 4.1.1 软件，对绞股蓝有效活性成分作用靶点和OP 相关靶点进行匹配，筛选出共同靶点，作为治疗OP 的潜在靶点，并制作维恩图。将得到的共同靶点输入STRING 11.5 版本（https://www.string-db.org），物种选择人类（homo sapiens），选取置信度高于0.9 的数据，获得蛋白相互作用（protein－protein interaction，PPI）关系，并构建网络关系图。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

将Bioconductor 软件包安装在R 4.1.1 软件中运行，将绞股蓝治疗OP 的靶点以官方名称“Gene Symbol”的格式输入，进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。将阈值设定为P＜0.05。筛选有显著性差异的生物学过程和通路。对GO 排名前十位的生物过程（biological process，BP）条目、细胞组成（cellular component，CC）条目、分子功能（molecular function，MF）条目及KEGG 排名前30 位的条目进行可视化。

2 结果

2.1 获取及筛选有效活性成分及其靶点

以“绞股蓝”为关键词在TCMSP 数据库中进行检索，共获得202 种成分，再按OB≥30%和DL≥0.18的条件对这202 种成分进一步筛选，获得24 种有效活性成分（表1）。

表1 绞股蓝有效活性成分基本信息

通过TCSMP 共获取绞股蓝作用靶点623 个，使用perl 软件，对绞股蓝的24 种有效活性成分所对应的靶点进行过滤，最终得到217 个对应靶点。运用UniProt 对获取的靶点标准化，剔除重复和非标准靶点。利用Cytoscape 3.8.2 软件完成绞股蓝的有效活性成分及预测靶点的关系网络图。结果显示，主要有效活性成分及作用靶点共存在169 个节点和192 条边。其中，主要有效成分MOL000098 所对应的靶点最多，共有138 个，其次为MOL000351，有19 个作用靶点，推测以上活性成分可能发挥了关键作用（图1）。

图1 绞股蓝有效活性成分-靶点网络关系图

2.2 获取OP 作用靶点

以“Osteoporosis”作为关键词输入输入GeneCards、OMIM、PharmGKB 和TTD 数据库进行搜索，最终获得疾病靶点4620 个。

2.3 获取绞股蓝有效活性成分作用靶点与疾病靶点的交集及构建网络关系图

将筛选出来的OP 作用靶点与获取的绞股蓝主要有效活性成分作用靶点取交集，获得121 个交集靶点（图2）。使用Cytoscape 3.8.2 软件，构建绞股蓝主要有效活性成分与交集靶点的网络，结果显示，共存在136 个节点和153 条边，其中包括有效活性成分节点15 个，靶点节点121 个（图3，封三）。

图2 绞股蓝主要有效活性成分作用靶点与OP 靶点的交集维恩图

图3 绞股蓝的主要有效活性成分与交集靶点网络关系图

2.4 PPI 网络的构建

向STRING11.5 数据库中导入121 个交集靶点，选择人类（homo sapiens），置信度设置为0.9，获得蛋白相互作用关系，绘制PPI 网络关系图。结果显示，共有节点121 个（其中有11 个游离节点），有420 条边，平均节点度值为6.94，平均聚集系数为0.417，P＜1.0×10。节点度值越大，越可能在有效活性成分靶点和疾病靶点的相互作用关系中起到重要的作用。度值排名前十位的靶点分别为JUN 原癌基因（JUN proto-oncogene，JUN）、肿瘤蛋白P53（tumor protein P53，TP53）、蛋白激酶（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、RELA 原癌基因（RELA proto-oncogene，RELA）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、丝裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、Fos 原癌基因（Fos proto-oncogene，FOS）、Mys 原癌基因（MYC proto-oncogene，MYC）、转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）（表2，图4，封三）。

表2 绞股蓝治疗OP 的关键靶点（节点度值排序前10 位）

图4 绞股蓝与OP 的蛋白质互作网络图

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

应用统计软件R 语言对靶点进行GO 富集分析，得到GO 条目2167 个，包括生物过程BP 条目1964个，CC 条目43 个，MF 条目160 个。BP、CC、MF 前10 条富集信息（图5）。KEGG 通路富集分析筛选后得到信号通路162 条，根据基因频率和qvalue 值排序，前30 的通路（表3、图6）。

表3 KEGG 通路富集分析表

图5 GO 功能富集分析图

图6 KEGG 通路富集气泡图

3 讨论

中药具有多成分、多途径、多靶点的复杂作用特征，这种复杂特征使得很多中药药效基础不明确，而且作用机制也不清楚。网络药理学是基于系统生物学的理论，利用“药物-疾病-靶点-基因”的生物信息网络关系，综合分析多种大数据来进行药理作用机制研究的模式。本研究通过网络药理学方法，利用相关软件及网络平台，筛选出绞股蓝的主要活性成分及其作用靶点、OP 的靶点、 绞股蓝治疗OP 的相关通路，来探讨绞股蓝治疗OP 的机制。

本研究筛选出绞股蓝治疗OP 的主要有效活性成分有Sitosterol、Campesterol、CLR、Spinasterol、3'-methyleriodictyol、Ruvoside、Quercetin 等15 种。其中，Quercetin 的作用靶点最多。Quercetin 是一种多羟基黄酮醇类化合物，广泛分布于多种植物中，如苹果、浆果、洋葱、西红柿、连翘、银杏叶，以及绞股蓝中。具有抗氧化、抗炎、心脏保护等多种生物学活性。有研究表明，Quercetin 可以通过细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路来促进骨分化。也有研究显示，Quercetin 能够清除衰老的骨髓间充质干细胞，并通过雌激素受体介导的通路，促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨向分化，从而改善骨组织结构及功能。而关于Rhamnazin 的医学相关研究，未见更多的报道。关于其与OP 的相互作用，有待进行下一步的研究。

绞股蓝与OP 的蛋白质相互作用网络图显示，JUN、TP53、AKT1、MAPK1、RELA、ESR1、MAPK14、FOS、MYC、STAT1 等靶点度值相对较高。有研究显示，AKT1 既促进骨细胞骨形成，也促进骨细胞骨吸收。AKT1 基因缺乏后成骨细胞的骨形成功能受损，可导致骨量减少。Mukkherjee 等也认为AKT1 能够抑制成骨细胞分化，并加速骨吸收。JUN 属于AP-1 转录因子家族，是JAK-STAT 信号通路上的基因，具有促进成骨细胞增殖、分化的作用。JUN 通过上调骨祖细胞相关基因的表达，诱导骨细胞增殖、分化，可以补偿骨缺损部位的骨量减少并促进其骨钙化组织形成，加速骨折愈合。TP53 基因编码的p53 蛋白可以调控细胞分裂和增殖。有学者认为，TP53 诱导的核蛋白2可能通过激活β-catenin 信号通路及自噬调控对人脂肪干细胞起到成骨分化的作用。

GO 功能富集分析结果表明，绞股蓝治疗OP 的分子功能主要体现在细胞对化学或氧化应激的反应、对药物的反应、活性氧反应、活性氧代谢过程、对脂多糖的反应、对细菌源性的分子反应等方面。成骨细胞前体细胞向成骨细胞分化可以被氧化应激抑制，从而抑制成骨细胞的矿化作用。但是这种机制尚不完全清楚。Byun 等根据研究推测，HO和肿瘤坏死因子α 通过激活c-Jun 氨基端激酶和核因子κB，从而导致人骨髓基质细胞（human bone marrow stromal cells，hBMSC）的凋亡。Park 等的研究提示氧化应激能够激活ERK 信号转导途径来影响成骨细胞的基因表达，从而介导氧化应激诱导的成骨细胞死亡。脂多糖可通过刺激免疫细胞和局部临近组织细胞增加炎症因子的表达，进而诱导宿主发生一系列免疫反应。而炎症因子可以通过多种途径来影响成骨细胞与破骨细胞的活性和功能，进而在OP 的发生发展中起着重要作用。

在绞股蓝治疗OP 的主要靶点进行KEGG 富集分析，按P＜0.05，最终得到162 条信号通路，推测绞股蓝通过多条信号通路在治疗OP 方面发挥作用。排名靠前的有脂质和动脉粥样硬化、化学致癌-受体激活、流体剪切应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症AGRRAGE 信号通路、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、丙型肝炎、前列腺癌、EB病毒感染等信号通路。

KEGG 富集分析显示，血脂和动脉粥样硬化通路注释基因数相对较多。近年来研究发现，高脂血症是OP 与动脉粥样硬化的共同病因。在骨组织中脂质可能通过氧化作用来抑制成骨细胞活性，阻碍正常骨生成。脂质持续聚集在骨组织间隙脂质的持续聚集，会发生糖基化修饰及氧化，诱发炎症反应和氧化应激，从而导致OP 形成。这个过程可能与Wnt/βcatenin 信号通路、Wnt/JNK 途径或Wnt/Ca途径的激活有关。

本研究基于网络药理学层面对绞股蓝治疗OP的作用机制进行了初步预测，其可能通过多靶点、多途径来实现其药效作用。但是，此次研究仅进行了数据分析来推测其作用机制，因此，下一步仍需要通过体内外实验来进一步验证。