microRNA-214靶向调控HOXB7基因抑制结直肠癌细胞侵袭转移的机制与意义

刘 英 何凤屏▲ 刘玉兰 李定云

1.汕头大学医学院附属粤北人民医院体检中心，广东韶关 512026；2.汕头大学医学院附属粤北人民医院检验科，广东韶关 512026；3.汕头大学医学院附属粤北人民医院胃肠外科，广东韶关 512026

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）为全球常见的三大恶性肿瘤之一，其死亡率排第三位。随着我国人民的生活节奏加快以及饮食结构改变，其发病率与病死率均持续升高，而且有年轻化的趋势，严重威胁着人类的健康。CRC 的病因尚未明确，其发病机理极其复杂、涉及到多阶段、多步骤、多基因改变的过程。目前国内外对CRC 的早期诊断仍处于较低水平，约半数的患者在明确诊断时已进入中期和晚期。因此，对CRC 发生发展及转移机制进行深入研究，寻找预防和治疗的有效途径，是目前国内外研究的热点，也是亟待解决的关键问题。本研究认为，microRNA-214（miRNA-214）上调导致HOXB7 基因下调，可能就是抑制CRC 细胞生长、侵袭、转移的关键所在点，为此进一步把Wnt/β-catenin 信号转导通路纳入研究范畴，分析其作用机制，旨在为CRC 转移的早期诊断和治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2020年12月汕头大学医学院附属粤北人民医院收治的200 例CRC 住院患者为研究对象，按照是否发生转移分为无转移组（100 例）和转移组（100 例），另选取同期健康体检者200 例为对照组。无转移组中，男68 例，女32 例；年龄23～65岁，平均（57.91±5.36）岁。转移组中，男71 例，女29 例；年龄23～66 岁，平均（58.01±5.40）岁；肝转移47 例，淋巴结转移53 例。对照组中，男115 例，女85 例；年龄21～64 岁，平均（56.39±5.24）岁。三组的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究已得到医院伦理委员会审批（批准文号：YBAF-2018-012），所有受试者均已签署知情同意书。

纳入标准：①入选患者均为初次诊治，首次接受抗肿瘤治疗（包括放疗、化疗、免疫治疗等）；②临床病理资料完整。排除标准：①合并有急性感染性疾病；②合并严重的心肝肾肺等器官功能不全；③患者拒绝接受检查；④经研究者判断患者不适合参加本研究；⑤标本不合格，不能进行检测的样本；⑥临床数据缺失或记录不规范样本。

1.2 方法

①收集血浆标本，所有研究对象均在清晨7:30 am，空腹抽取静脉血检测常规肿瘤标志物，同时抽取5 ml 静脉血置于EDTA 试管中，立即送到实验室提取DNA 或RNA，并放置于-80℃冰箱中保存备检。②利用人CRC 细胞SW480、SW1116（上海慧颖生物科技有限公司）进行实验；③采用实时荧光定量PCR技术分别检测miRNA-214、HOXB7、Wnt/β-catenin 的mRNA 的表达，并作相关性分析。检测miRNA-214、HOXB7、Wnt/β-catenin 的引物和探针由上海生物工程技术服务有限公司提供，在BIO-RAD CFX96 实时荧光定量PCR 仪上进行荧光扩增和检测其相对表达量。④采用miRanda、PicTar 和Tar-getScan 数据库预测miRNA-214 的靶基因。⑤利用基因敲除和转染技术验证miRNA-214 通过靶向HOXB7 基因调控Wnt/β-catenin 的表达的作用机制。⑥将miRNA-214 模拟物和重组有HOXB7 基因3' UTR 区miRNA-214 潜在结合位点的野生型和突变型的荧光素酶报告基因分别转染到CRC 细胞系SW1116 和SW480 细胞，并检测HOXB7 mRNA 和蛋白水平，为了进一步研究miRNA-214 和HOXB7 之间的直接结合和抑制作用，24 h 后检测荧光素酶活性，对HOXB7-wt-3' UTR 及其突变体型（FGFR1-mt-3' UTR）进行扩增和克隆pGL3 中荧光素酶报告基因，进一步验证miRNA-214对HOXB7 基因的直接靶向调控促进CRC 细胞侵袭和转移的能力。

观察三组中miRNA-214、HOXB7、Wnt/β-catenin的表达，分析三者的联系，并且分析对CRC 细胞生长和迁移的影响。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 三组miRNA-214 表达情况的比较

转移组和无转移组的miRNA-214 表达量分别为（1.23±0.34）和（2.05±1.19），均低于对照组的（5.94±1.84）（t值=27.69，P值＜0.05；t值=21.51，P值＜0.05），且转移组低于无转移组，差异有统计学意义 （t=21.51，P＜0.05）（图1）。

图1 三组miRNA-214 表达情况的比较

2.2 miRNA-214 在CRC SW1116、SW480 细胞株中的表达情况

miRNA-214 在CRC SW1116 细胞株中的表达量为（3.57±1.89），低于对照组的（6.13±2.17），差异有统计学意义（t=24.31，P＜0.05）；miRNA-214 在SW480 细胞株中的表达量为（2.86±1.74），低于对照组的（5.58±2.03）（t=23.78，P＜0.05）（图2～3）。

图2 miRNA-214 在CRC SW1116 细胞株中的表达量

图3 miRNA-214 在CRC SW480 细胞株中的表达量

2.3 miRNA-214 对HOXB7 基因、CRC 细胞生长和迁移的影响

首先评估FGFR1 敲除是否可以模拟miRNA-214过度表达的效果，用si RNA 转染SW1116 细胞获得HOXB7；Western 印迹分析证实HOXB7 表达减少（图4A）。用miRNA-214 模拟物转染SW1116 和SW480细胞，并且检测HOXB7 mRNA 和蛋白水平，研究结果表明，在SW1116 和SW480 细胞生长和转移的过程中，miRNA-214 呈高表达，HOXB7 呈低表达。与对照组比较，转染si-HOXB7 的SW1116 和SW480 细胞显示减少细胞集落形成 （P＜0.05）（图4B），其效应与miRNA-214 过表达相似。

图4 Western blot 检测miRNA-214、HOXB7、si-HOXB7 的表达

2.4 HOXB7 在CRC 组织和细胞株中的表达

与对照组比较，HOXB7 在SW1116 和SW480 细胞株中呈高表达水平（图5A），HOXB7 在CRC 无转移组和CRC 转移组呈现高表达水平（图5B）。

图5 HOXB7 在CRC 组织和细胞株中的表达

2.5 miRNA-214 与HOXB7 表达的相关性分析

数据库预测结果表明，HOXB7 具有良好的生物活性，miRNA-214 潜在的结合位点在3' UTR 区域中（图6A）。miRNA-214 模拟物转染结果表明，HOXB7表达受miRNA-214 负调控（图6B、C）。实时荧光定量PCR 检测结果显示，在CRC 患者组织和CRC SW1116 细胞中，miRNA-214 与TOXB7的表达水平呈负相关（r=-0.394，P＜0.01）（图6D）。

图6 HOXB7 表达及其与miRNA-214 的相关性分析

2.6 miRNA-214 与HOXB7 荧光酶活性的相关性分析

在共转染的细胞中，与阴性对照细胞和空白细胞相 比，pcDNAmiRNA-214 在SW1116 和SW480 细 胞中的HOXB7-wt-3' UTR 荧光素酶活性降低（P＜0.05）（图7A），且在HOXB7-mt-3' UTR 和pcDNAmiRNA-214 之间没有发现荧光素酶活性的差异（图7B）。

图7 分析miRNA-214 与HOXB7 荧光酶活性的表达

2.7 miRNA-214 模拟物对HOXB7 表达的影响

miRNA-214 模拟物降低了SW1116、SW480 细胞中HOXB7 的表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 miRNA-214 模拟物对HOXB7 表达的影响

2.8 HOXB7 表达对Wnt/β-catenin 表达的影响

采用免疫荧光染色技术检测CRC SW1116 细胞发现，当HOXB7 过表达后，Wnt/β-catenin 表达也增高；而在加入miRNA-214 干扰HOXB7 后，Wnt/βcatenin 表达明显下降（图8）。

图8 HOXB7 表达对Wnt/β-catenin 表达的影响

3 讨论

CRC 为最常见的恶性肿瘤之一，早期无明显症状，容易发生转移，大部分患者在明确诊断时就发生转移了。近年来的研究发现，50%的原发性CRC 患者同时伴有肝转移，而且部分病人在接受原发肿瘤手术切除和辅助化疗后仍出现肝转移。其预后与诊断时机密切相关，这导致预后差和病死率高的重要因素，可见侵袭和转移是造成CRC 患者死亡的首要原因。

肿瘤细胞发生-发展-侵袭-转移的过程是肿瘤细胞与宿主细胞之间相互作用的连续动态过程，这个过程是复杂的、多步骤的，多种细胞组分、相关基因以及标志性分子参与，并形成复杂的相互作用网络。miRNA 是一种具备调控功能的小分子RNA，miRNA-214 在多种恶性肿瘤中低表达，而在癌旁正常组织中高表达，提示其可能具有抑制基因的特性。近年来研究发现，miRNA-214 与多种恶性肿瘤相关，可通过多种信号转导途径发挥抑癌和促癌作用。miRNA-214 在CRC 中表达下调，参与了CRC 的发生和发展，在癌细胞增殖过程中miRNA-214 可能直接或间接调控某些蛋白mRNA 3'UTR 区，使蛋白合成抑制减少，使细胞周期与细胞增殖活性失调而发生恶性转化。HOXB7 基因属同源异型盒基因HoxB 家族，是一种很重要的转录调控因子，在正常组织中几乎不表达。HOXB7 基因的异常表达被国外学者证实与肿瘤的临床恶性程度和不良预后有密切相关。本实验研究的核心指标HOXB7 基因最初是在研究肿瘤新生血管生成过程中被发现的，它可以通过调节肿瘤细胞分泌相关细胞因子促进肿瘤转移，推测其与肿瘤的血管生成有关。Wnt 为一种分泌型糖蛋白，导致β-catenin 积累。β-catenin 即β-连环蛋白，游离的β-catenin 进入细胞核，可以调节基因表达，其异常表达或激活能引起肿瘤。Wnt 信号通路为一种复杂的蛋白质作用网络，最常见于胚胎发育及恶性肿瘤，而即Wnt/β-catenin 是经典的Wnt 信号通路，可激活核内靶基因的表达。

本研究结果显示，miRNA-214 在CRC 转移和CRC 无转移患者组织中的表达量分别为（1.23±0.34）和（2.05±1.19），低于在结直肠切缘无瘤黏膜组织中的表达量；miRNA-214 在CRC SW1116 和SW480 细胞株中的表达量均低于在正常细胞株中的表达量（P ＜0.05）。用miRNA-214模拟物转染SW1116 和SW480 细胞发现，在SW1116 和SW480细胞生长和转移的过程中，miRNA-214 高表达抑制了HOXB7 的表达，降低了HOXB7 mRNA 和蛋白水平。研究结果提示，在大肠癌细胞系中，HOXB7 是miRNA-214 的靶基因，两者之间的表达水平呈负相关（r=-0.394，P＜0.01），miRNA-214 低水平表达激活HOXB7 基因，并促进CRC 细胞生长和迁移，而miRNA-214 高表达会抑制HOXB7 基因，进而抑制CRC 细胞生长和迁移。HOXB7敲除可以达到模拟miRNA-214 高表达的效果，沉默HOXB7 显示，miRNA-214 高表达会抑制CRC 细胞侵袭和迁移。而且HOXB7 在CRC 无转移和CRC 转移患者呈现高表达水平，在SW1116 和SW480 细胞株中也呈高表达水平，CRC 发生转移的患者血清中HOXB7 的浓度高于未发生转移的患者，表明HOXB7基因与CRC 发生发展密切相关。HOXB7 基因表达上调，既提高了CRC 细胞的运动和侵袭能力，又激活免疫系统的巨噬细胞，提示HOXB7 基因可能是肿瘤细胞激活和利用自身免疫系统的重要枢纽。实验研究采用免疫荧光染色技术，检测CRC SW1116 细胞中HOXB7 过表达后的Wnt/β-catenin 表达情况，结果发现，当HOXB7 过表达后，Wnt/β-catenin 表达也增高；当加入miRNA-214 干 扰HOXB7 后，Wnt/β-catenin表达明显下降，提示HOXB7 通过Wnt/β-catenin 通路发生作用。

因此，本研究认为miRNA-214 就是一个新的抑癌因子，miRNA-214 上调导致HOXB7 基因下调可能就是抑制CRC 细胞生长、侵袭、转移的关键所在点，这提示miRNA-214—HOXB7—Wnt/β—catenin 通路可能作为未来潜在的CRC 抗癌细胞侵袭和转移疗法的新靶点。本项目从多个方面和多个层次研究miRNA-214 靶向HOXB7 基因调控Wnt/β-catenin 通路，阐明该通路参与抑制CRC 侵袭和转移的分子机制，这为早期辅助诊断CRC 提供了新的检测手段。总结来看，本项目的创新点在于，首次提出miRNA-214靶向HOXB7 基因调控抑制CRC 细胞生长、 侵袭、迁移的分子机制，首次提出miRNA-214 的表达调控Wnt/β-catenin 信号通路发挥抑制CRC 细胞侵袭和转移的作用机制。本项目的研究一方面提示了miRNA-214—HOXB7—Wnt/β—catenin 通路可能作为未来潜在的CRC 抗癌细胞侵袭和转移疗法的新靶点，另一方面也可以作为临床诊断和预后评价的新分子标志物，这为CRC 诊断和治疗提供了新的靶点。因此，本项目的研究具有较大的临床价值和科学意义。