基于药物相互作用研究麦冬皂苷D对麦冬皂苷D′急性和亚急性毒性的影响

徐焕华，江珍红，姚泓，汤响林，王宁宁，孙宇婷，马增春，高月1，

（江西中医药大学 1.现代中药制剂教育部重点实验室，2.创新药物与高效节能降耗制药设备国家重点实验室，江西南昌 330004；3.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850；4.江西省分子中心医学重点实验室，江西南昌 330006）

本研究集体前期在对麦冬中的活性成分麦冬皂苷D（ophiopogonin D，OPD）与OPD'进行比较研究时发现，互为同分异构体的2 个分子在药理活性方面存在明显差异［1］。检索目前与OPD 和OPD'相关的文献，其中OPD 占87.7%，且药理研究均表明OPD 具有心血管保护作用［2-6］。与此相反，其同分异构体OPD' 2 μmol·L-1即对细胞产生明显的细胞毒性，细胞存活率仅为41%［7］；动物实验结果亦表明其具有显著的心脏毒性。因此，应当重视OPD'存在的临床风险。

本研究集体已研究表明，OPD'在体内和体外均具有明显的溶血作用，而OPD 仅在体内发生溶血，且两者在体外溶血方面存在药物相互作用［8］。近来研究报道，OPD'具有促进肿瘤细胞凋亡的作用，或许可应用于治疗某些癌症［9-10］。但以实际情况看，OPD'抑制肿瘤细胞活性的作用有可能是其细胞毒性，其成药性值得商榷。为此，本研究基于药物相互作用观察OPD 对OPD'急性毒性和亚急性毒性的影响，为后续OPD'的药理研究提供参考，也为临床使用参脉注射液提供合理建议。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂和仪器

SPF 级昆明小鼠150 只，雌雄各半，体重18～22 g；SPF级SD大鼠25只，雄性，体重180～220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2018-0011。动物饲养于军事医学研究院动物保障中心，环境许可证号为SCXK-（军）2002-003。室温控制在18～28℃，湿度40%～80%，12 h循环照明-黑暗。动物由获得资格认可的人员饲养并自由饮食饮水。伦理审查批号：IACUCDWZX-2020-684。

OPD 和OPD'（批号：F059758 和F581298），上海一飞生物科技有限公司；40%甲醛溶液（批号：1603062），西陇化工股份有限公司；甲醇，美国Thermo Fisher科技有限公司。BS110S型十万分之一天平，德国Sartorius 公司；XH-89 型旋涡振荡器，浙江乐成电器厂；ES-502HA型百分之一天平，中国湘平公司；DM3000型LEICA显微成像系统，德国莱卡公司；XT-2000i型血细胞分析仪，日本Sysmex公司；Cobas c 311型生化分析仪，瑞士Roche公司。

1.2 急性毒性试验

将昆明小鼠随机分为OPD'单用、OPD+OPD'（OPD 和OPD'提前混合）和OPD→OPD'（先注射OPD 间隔15 min 再注射OPD'）组。OPD'单用组OPD'5 个剂量分别为3.127，6.460，9.979，10.245和13.098 mg·kg-1；OPD+OPD'组OPD 和OPD'1∶1 混合，5 个剂量分别为5.711，6.129，7.626，8.712 和10.262 mg·kg-1；OPD→OPD'组OPD 固定为1.0 mg·kg-1，OPD' 5 个剂量分别为11.351，15.551，22.732，26.568 和30.137 mg·kg-1；共15组，每组10只，单次尾静脉注射5 mL·kg-1。给药后即刻观察小鼠行为表征，并记录死亡数。14 d 后计算LD50。对死亡小鼠剖检，记录大体观察结果，部分有明显病变的组织进行组织病理分析。

1.3 亚急性毒性试验

据急性毒性试验结果，亚急性毒性试验主要考察OPD'和OPD 药物之间的相互作用，因此未设梯度剂量。据急性毒性试验OPD'的LD50值及体外溶血试验测得的临床允许溶血的限度值（5%）［8］，OPD'和OPD 均设为0.25 mg·kg-1。将SD 大鼠分为正常对照、OPD、OPD'、OPD+OPD'和OPD→OPD'组，每组5只。尾静脉注射给药（1 mL·kg-1），每天1 次，持续给药30 d。每天观察并记录大鼠行为表征，间隔7 d 称量1 次体重。末次给药前12 h，禁食不禁水。待末次给药结束后，记录体重，二氧化碳麻醉处死，取材，记录各脏器重量，并计算脏器指数（脏器重量/体重×100）。将心、肝、脾、肺和肾等组织置4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，进行HE 染色，观察组织病理变化。收集血液，EDTA抗凝，制备血浆，分析血浆成分。另取部分血液，离心制备血清，测定血清生化指标。

1.4 统计学分析

急性毒性试验采用Bliss 法计算不同给药组小鼠的LD50，将各组得到的数据录入GraphPad Prism 6软件，经计算得到LD50和95%可信限区间。小鼠体重以±s表示，采用SAS 8.2 统计软件先进行组间单因素方差分析，方差齐则采用非配对t检验进行组间比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 OPD′急性毒性

注射OPD'后，OPD'各剂量组小鼠死亡时间区间在4 min～1 h，多数小鼠在给药后约15 min 死亡，但6.460 和9.979 mg·kg-1组在给药后第7 天各只有1 只死亡。给药14 d 时小鼠死亡数见表1。小鼠注射给药后立即出现呼吸急促、运动不协调、痉挛、四肢和全身颤抖和震颤、心动过速、心率增加和尿失禁等，推测小鼠死亡原因可能与神经系统有关。死亡小鼠大体解剖均未发现肉眼可见的病理改变（图略）。据各剂量组小鼠死亡数，计算得OPD'单用时LD50值为7.785 mg·kg-1，95%可信限为6.814～8.893 mg·kg-1。

OPD+OPD'各剂量组给药后小鼠行为反应和死亡时间分布与OPD'单用组相似，其中6.192 和8.172 mg·kg-1组在给药后第4天分别有1只小鼠死亡。给药14 d 时小鼠死亡数见表1。为便于比较，最终剂量以OPD'计，根据各组小鼠死亡数，计算得LD50值为7.706 mg·kg-1，95%可信限为6.959～8.534 mg·kg-1。

OPD→OPD'各剂量组给药后小鼠行为反应和死亡时间分布与OPD'和OPD+OPD'组一致，其中26.568 和30.137 mg·kg-1组分别有1 只小鼠在第7 天死亡。给药14 d 时小鼠死亡数见表1。剂量以OPD'计，计算得LD50值为22.820 mg·kg-1，95%可信限为19.86 ～26.22 mg·kg-1。

2.2 OPD′亚急性毒性

2.2.1 对体重和脏器系数的影响

由表2 可见，与正常对照组相比，OPD'，OPD，OPD+OPD'和OPD→OPD'组大鼠体重均下降（P＜0.05，P＜0.01），心、肝和肾指数无明显变化，脾指数增大（P＜0.05，P＜0.01）；OPD'，OPD+OPD'和OPD→OPD'组肺指数增大（P＜0.05，P＜0.01）。OPD+OPD'和OPD→OPD'组与OPD 或OPD'组比较，体重和以上脏器指数均无显著性差异。

Tab.1 Acute toxicity of ophiopogonin D′（OPD′）in mice

Tab.2 Effect of OPD and OPD′ on body mass and organ indices of rats in sub-acute toxicity test

2.2.2 对血常规指标的影响

如表3 所示，OPD 组大鼠白细胞数较正常对照组明显降低（P＜0.05，P＜0.01），但尚在正常生理范围；各组淋巴细胞百分比与正常对照组比较均降低（P＜0.05）。OPD+OPD'和OPD→OPD'组与OPD或OPD'比较，以上指标均无显著性差异。红细胞及溶血相关指标另文发表［11］。

Tab.3 Effect of OPD and OPD′ on hematological parameters of rats in sub-acute toxicity test

2.2.3 对血生化指标的影响

共检测血生化指标18项，其中白蛋白、间接胆红素、碱性磷酸酶、总胆汁酸、肌酸肌酶、尿酸、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和血清胆碱酯酶等9项各给药组与正常对照组比较无显著改变（数据略）。如表4 所示，各给药组谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、总胆固醇、总胆红素、尿素氮和肌酐与正常对照组比较无明显变化，血清葡萄糖和甘油三酯水平均显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。与OPD 或OPD'比较，OPD+OPD'和OPD→OPD'组以上指标均无显著性差异。

2.2.4 对主要脏器组织病理变化的影响

与正常对照组比较，各给药组肝和肾组织无明显病理改变（图略），心、肺和脾组织具有明显病理改变。

2.2.4.1 对心脏组织病理变化的影响

如图1所示，各组大鼠心肌中层结构正常，中层纤维排列整齐、横纹清楚，肌浆丰富，核圆形或卵圆形，染色质清晰。各给药组心内膜均出现部分心肌细胞轻度水肿、核周间隙轻度增宽，灶性或小片状心肌颗粒变性、肌浆凝聚、均质化，间质血管淤血。OPD+OPD'组病理改变程度最为明显，其中1 例出现灶状心肌细胞坏死、成纤维细胞增生和单核细胞浸润。

2.2.4.2 对脾组织病理变化的影响

如图2 所示，各组脾组织结构基本正常，红、白髓分界较清楚，脾小体及淋巴细胞等形态结构正常；各给药组红髓轻度淤血，其中OPD→OPD'组红髓明显淤血，较OPD，OPD'和OPD+OPD'组更为明显。各给药组均未见明显出血。

2.2.4.3 对肺组织病理变化的影响

如图3 所示，各组肺组织结构基本正常。各给药组部分肺泡上皮细胞轻度肿胀，核周间隙增宽，部分细胞核染色质浓缩深染，肺泡壁血管不同程度淤血，单核细胞稍增多，导致肺泡隔轻至中度增宽，其中OPD，OPD+OPD'和OPD→OPD'组病理改变较OPD'组较轻。

Tab.4 Effect of OPD and OPD′ on blood biochemical indexes of rats in sub-acute toxicity test

3 讨论

因OPD'和OPD 均存在水溶性差的问题，特别是OPD'，因此在药液制备时加入不同比例的甲醇作为溶剂。急性毒性预试验结果表明，控制甲醇含量＜20%不会引起小鼠死亡。在亚急性毒性试验中，因给药浓度小且持续时间长，药液制备时可适当添加乙醇促溶，但乙醇含量不得＞15%。依据《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）的评价要求，该含量在用于毒理学试验中是一个可被接受的溶剂剂量。

关于OPD'和OPD 之间的药物相互作用，据本课题组研究结果，可从3 个方面互为印证。①本研究急性毒性试验结果表明，与OPD'单用相比，当OPD'和OPD 提前混合使用时LD50量效曲线无变化，而当先注射OPD、间隔15 min 再注射OPD'时LD50量效曲线明显右移。在亚急性毒性试验中未见该现象，可能与亚急性毒性的重复给药密切相关。②体外溶血实验结果［8］与急性毒性试验结果一致。与OPD'单用相比，当OPD'和OPD 提前混合使用时，其发生溶血的剂量更低，程度更高；然而当先注射OPD、间隔15 min 再注射OPD'时，溶血发生的剂量升高，程度降低，提示OPD 可减轻OPD'的溶血作用。③本课题组王佳等［12］实验结果表明，OPD干预内质网应激能减轻OPD'所致心肌细胞损伤。但不同的是，该研究中采取的是共处理模式，并未考察间隔给药，且结果也提示两者之间存在药物相互作用。

一般来说，药物相互作用可能与两者作用在同一个靶标有关［13-14］。因此，本课题组利用分子模拟技术，以OPD'寻靶，再辅以OPD验证，找到了10个两者共同的靶标［11］，其中Q9NPD5可能与溶血存在一定的关联性［15-16］。本研究结果表明，在急性毒性试验中，小鼠死亡集中在给药后30 min 内，大体解剖观察未见脏器肉眼可见的变化。但在亚急性毒性试验中所呈现出来的异常结果，如体重降低、脾指数和肺指数增大、心肌细胞轻度水肿和间质血管淤血、脾红髓淤血、肺泡上皮细胞轻度肿胀及肺泡壁血管不同程度淤血等均与溶血相关。基于Q9NPD5 靶标的深入研究或许可揭示两者在溶血方面的相互作用机制［17-18］。但两者之间的药物相互作用应不止于此，还有待更深入研究。

关于亚急性毒性试验剂量的设置，本课题组任思嘉等［19］在研究OPD'的心脏毒性时使用的剂量为0.5，1.0 和2.0 mg·kg-1，本研究设置的剂量为0.25 mg·kg-1。该剂量设置的依据主要是急性毒性试验结果的LD50值；其次是体外溶血试验测得的临床允许溶血的限度值（5%），该限度值下，OPD'的浓度为5 mg·L-1［11］。根据动物体重换算，本研究亚急性毒性试验设置OPD'的剂量为0.25 mg·kg-1。

本研究亚急性毒性试验的血生化结果表明，各给药组血糖和血脂与正常对照组比较均显著降低，提示OPD'和OPD 均具有降低血糖和血脂的作用。OPD 用于代谢综合征的治疗已有报道［20］，表明OPD 能通过调整肠道菌群结构进而改善高脂饮食诱导的代谢综合征，但关于OPD'的类似研究还未见报道。本课题组首次发现OPD'具有降低血糖和血脂的药理活性，为后续研究OPD'药理活性提供参考。

笔者前期对收集到的国内市场生产的每厂家各3 批次的参脉注射液进行溶血作用检测，结果均符合药典规定，未发生溶血。但对收集样品中OPD'含量的测定结果显示，不同企业中OPD'含量差异巨大［21］，个别企业OPD'含量按临床使用最大剂量计算，已触及亚急性毒性试验中采用的临床允许的溶血限度值（5 mg·L-1）。因此，基于本研究结果，建议明示制剂中OPD'的含量并予以控制，以在保证安全剂量范围的前提下选择临床用药剂量。