细菌分选酶A抑制剂抗革兰阳性超级细菌感染的作用及其应用前景

王琦，艾常虹，商庆辉

（1.呼伦贝尔市人民医院，内蒙古呼伦贝尔021000；2.呼伦贝尔市中蒙医院，内蒙古呼伦贝尔021000；3.内蒙古民族大学呼伦贝尔医学院，内蒙古呼伦贝尔021000）

多重耐药菌是指同时对≥3 种抗菌药物耐药的细菌，常被称为超级细菌，其中引起广泛关注的有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐多药肺炎链球菌、耐万古霉素肠球菌、多重耐药性结核杆菌、多重耐药鲍曼不动杆菌以及最新发现的携带有新德里金属-β-内酰胺酶1(New Delhi metallo-beta-lactamase-1，NDM-1）基因的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等，它们导致的感染性疾病的发病率和死亡率逐年升高，给人类健康带来了严重威胁［1］。据估计，当前抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance，AMR）每年在全球造成约70万人死亡，到2050年死亡人数可能增加到每年1000 万人；另外，到2050 年AMR 感染所消耗的全球医疗成本累计将达到100 万亿美元［2］。因此，AMR 将成为人类在21 世纪面临的最大挑战之一。

目前，抗菌药物仍是治疗细菌感染的主要方法。传统抗菌药物一般为小分子，通过与细菌DNA、RNA、蛋白质或细胞壁的相互作用发挥杀菌或抑菌作用［3］。随着AMR 的加剧，传统抗菌药物的疗效明显降低［4］，为此人们采取各种方法来应对AMR，包括持续改进抗菌药物管理、使用百里酚和没食子酸等细菌细胞膜通透剂提高抗菌效果、开发新的抗菌药物或疫苗及采取抗毒力疗法等［5～6］。其中，抗毒力疗法是以毒力因子为作用靶点的治疗方式。毒力因子是促进宿主内感染和细菌繁殖的细菌衍生分子［7］，借助这些毒力因子，细菌可以克服宿主防御系统和抗菌药物的攻击，使细菌适应和定植于目标靶点［8］。针对毒力因子进行靶向治疗虽无法消灭病原体，但可削弱或完全阻断病原体入侵宿主的能力，并且不会对细菌施加选择压力，从而可降低细菌产生耐药性的风险。此外，由于大多数毒力因子被限制在少数相关菌种，所以耐药的决定因素通过水平基因转移的传播风险是降低的。因此，抗毒力疗法可能成为一种更安全的抗感染策略，并可有效克服抗菌药物治疗时存在的耐药风险［5］。

细菌分选酶A（sortase A，SrtA）是一种细菌细胞膜酶，可将表面蛋白附着在细菌的细胞壁上，是革兰阳性致病菌（如金黄色葡萄球菌）的关键毒力因子，其在细胞膜上的定位也是靶向治疗的重要靶点。因此，SrtA 对于抗毒力疗法的研究具有重要价值，在应对AMR 方面也具有重要意义［9］。本文简要介绍AMR 的流行病学及其耐药机制，着重阐述SrtA 的结构、作用机制及抑制剂的研究进展，以期为革兰阳性超级细菌感染寻找新的治疗方案。

1 抗菌药物的耐药性

1.1 流行病学

多重耐药的肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌等“超级细菌”导致的感染相关发病率和死亡率逐渐升高［10］。在美国，每年至少有280万株耐药菌感染发生，导致3.5万人死亡［11］；在欧洲，每年约有2.5万人死于耐药细菌感染［12］。近年来，全球各地相继报道了多种耐药菌，如美国发现了耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae）［13］，印度和巴基斯坦发现了blaNDM-1基因介导的耐碳青霉烯大肠埃希菌（carbapenem resistanceE.coli）和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌［14］，中国发现了含有黏菌素耐药基因mcr-1的大肠杆菌［15］。在澳大利亚，常见革兰阴性菌（如大肠杆菌）的耐药性不断增加，养老院和医院中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）以及耐万古霉素屎肠球菌的流行率不断升高［16］，可见全球范围内的抗菌药物耐药形势都十分严峻。

1.2 耐药机制

研究表明，AMR 的产生主要是源于抗菌药物对微生物施加的选择压力［17］。AMR 大体分为2 类，一类是固有耐药性，即引起AMR 的基因在细菌中代代相传，使得细菌对抗菌药物产生天然耐药性［18］；另一类是获得性耐药性，即细菌由于基因突变或获得外来耐药性基因，或两者兼而有之，从而获得了抵抗抗菌药物活性的能力［19］。

如图1所示，目前研究较充分的AMR 机制主要有4 种，即酶促药物降解、药物靶点突变、药物外排泵的激活和膜通透性的降低［4］。此外，其他因素也可导致AMR。据统计，80%细菌感染与细菌生物膜（简称生物膜）形成相关，生物膜中的细菌形态和生理作用均与游离菌不同，对抗菌药物的耐受性可提高10～1000 倍，且对宿主免疫防御的抗性很强，是造成细菌耐药性的主要原因［20～21］。当细菌暴露于较低浓度抗菌药物时，一旦形成生物膜就会产生适应性耐药，进而导致耐药性的发展。研究表明，生物膜的形成可受毒力因子、温度、糖浓度和pH 值等因素的影响，而AMR 与毒力因子之间可能也存在着很强的关联性［22］。毒力因子是细菌产生的一种使细菌能附着在宿主细胞上的分子，常见的包括菌体表面的黏附结构，如菌毛、荚膜及类荚膜，还包括一些具有侵袭能力的水解酶，细菌代谢产生的部分脂多糖和蛋白质也属于毒力因子的范畴。一方面，毒力因子可使病原菌在机体内定殖、突破机体的防御屏障、内化、繁殖和扩散，这种能力被称为侵袭力；另一方面，毒力因子也具有一定毒素的性质，病原菌之所以能感染宿主并在宿主环境中繁殖，通常就是依靠一系列毒力因子相互协调作用实现的。人在感染有毒细菌并出现疾病症状后开始抗菌药物治疗，进而导致AMR 的出现，可见毒力因子和AMR之间存在着直接关系［22］。

2 细菌分选酶A

近年来，使用抗毒力疗法治疗细菌感染受到越来越多的关注。与传统抗菌药物限制细菌生长或直接杀死细菌相比，抗毒力疗法降低了细菌的毒性，增加了病原体对宿主免疫系统的敏感性，因此，细菌毒力因子可能是研发新型抗菌药物的全新方向［23］。在众多已知的毒力因子中，存在于大多数革兰阳性菌中的Srt 受到了特别的关注。Srt 可分为8类，分别是A，B，C，D1，D2，E，F和“Marine”，每类均有自己的底物识别基序和功能。SrtA 是一类膜结合的巯基转肽酶，其功能是将包括毒性因子在内的表面蛋白连接到细菌细胞壁上，而这些表面蛋白作为多种毒力因子之一，在革兰阳性菌对宿主的入侵中起着重要作用［24］。SrtA 在革兰阳性菌的发病机制中是不可或缺的，但对其生长或生存能力却并不是必需的。因此，SrtA 是研发新型抗感染药物的非常有价值的靶点，这些新型抗感染药物可抑制生物膜形成等关键的细菌毒力机制，且不会引起耐药性［25］。此外，SrtA 做为一种细菌细胞膜酶，与细胞内靶点相比具有更好的靶向性［26］。

2.1 细菌分选酶A的结构

SrtA 是一种管家蛋白，可将带有LPXTG 基序的蛋白共价结合到细菌细胞壁上［27］。金黄色葡萄球菌SrtA N 端第1～59 氨基酸残基中包含一个将其定位到细胞膜上的信号肽和一个螺旋膜锚。第60～206氨基酸残基代表核心催化域，该催化域具有8股β 桶状褶皱结构，即Srt 褶皱，其中由β7 和β8 链形成SrtA的活性中心，而His120，Cys184和Arg197是活性中心不可缺少的3 个氨基酸，尤其是位于SrtA 特征基序LXTC上的Cys184具有催化活性［28］。此外，β3 和β4 环形成钙结合位点，钙离子可与β6/β7 环中的残基相互协作，这种钙离子的结合效应减缓了SrtA的运动，使得底物与酶结合，导致酶活性增加8倍［29］。

2.2 细菌分选酶A的作用机制

SrtA 通过微生物表面成分识别黏附基质分子（microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMM）中的LPXTG基序发起黏附过程。在完成识别过程之后，SrtA 接连催化硫酯化反应和转肽化反应。SrtA 的催化性半胱氨酸残基Cys184 首先在苏氨酸残基和甘氨酸残基之间裂解LPXTG 基序，并产生酰基硫酯酶中间体。在此过程中，首先需要组氨酸残基His120的咪唑环形成硫酸盐从而激活Cys184；同时，精氨酸残基Arg197 通过提供稳定的四面体氧阴离子过渡态和激活反应所需的能量，可助Cys184 进行裂解反应［30-31］。随后，该硫酯被细菌肽聚糖中五甘氨酸（penta-Gly，Gly5）序列的N端氨解。这种转肽化反应导致MSCRAMM 的C 端苏氨酸和肽聚糖Gly5序列之间形成酰胺连接，该连接将蛋白质共价连接到细菌细胞壁上［30-31］（图2）。SrtA 通过识别、硫酯化和转肽化将MSCRAMM 锚定在细菌肽聚糖上，因此抑制上述步骤中的任何一个，均可导致细菌不能附着在特定的组织和（或）器官上，使细菌无法攻击宿主细胞，同时无法逃避宿主的免疫反应［32］。

3 细菌分选酶A抑制剂

目前，研究人员已筛选出多种类型的SrtA 抑制剂（SrtA inhibitor，SrtAi），包括合成小分子、多肽和其他天然产物等，这些SrtAi对金黄色葡萄球菌以及MRSA 都具有一定的抑制作用，而且不会产生传统抗菌药物常见的相关不良反应［33］。

3.1 合成小分子

目前，研究人员通过分子对接与分子动力学模拟筛选出了小分子药物数据库，用以识别能结合SrtA 活性位点的化合物，并对部分化合物的抑制作用进行了生物评价。如研究人员对绿原酸（chlorogenic acid，CHA）及其类似物进行了荧光共振能量转移分析，以确定CHA对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）及对SrtA 活性的半数最大抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）。结果显示，CHA对金黄色葡萄球菌的MIC＞1024 μg·mL-1，对SrtA 活性的IC50为34 μg·mL-1，表明CHA与SrtA活性位点的结合阻止了SrtA 与MSCRAMM 中LPXTG 基序的结合，从而使SrtA 失去了生物活性［34］，但对金黄色葡萄球菌无明显抑菌作用。

研究人员利用基于结构的药物设计方法，对具有SrtA 生物活性抑制作用的合成小分子进行了优化，并通过高通量筛选技术证实吡嗪酮类分子是有效的SrtA 抑制剂。Chan 等［35］合成了一系列高可溶性吡嗪酮基小分子，并推测它们可能与Cys184形成二硫键，因而可共价修饰SrtA 的活性半胱氨酸硫醇基团。此外，这些小分子也部分模仿天然SrtA底物，可引起酶活性部位的构象变化。其中，化合物2-（3-氟苯）-4-（3-羟丙氧）-5-巯吡啶嗪-3（2H）-酮展现出理想的SrtA 抑制作用，IC50为（21±14）nmol·L-1，具有更低的细胞毒性，且可有效破坏金黄色葡萄球菌表面蛋白。

3.2 多肽

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMP）为传统抗菌药物治疗耐药菌感染带来了一种替代或补充方案。它们是一种阳离子多肽，可与带负电荷的分子（如革兰阳性菌的重要表面抗原脂磷壁酸）发生静电作用，从而进入细胞质膜与脂质双分子层相互作用形成跨膜孔，进而导致细胞膜的生物作用呈剂量依赖性减弱［36］。AMP 由15～50 个氨基酸组成，可折叠成不同二级结构，包括α-螺旋、β-折叠、环和扩展螺旋，它们可通过非特异性作用机制抑制细菌，从而导致细菌细胞破坏。由于AMP的作用模式通常不是通过特定的生化途径实现，因此未观察到细菌对这类抗菌药物产生耐药性［37］。

人类β-防御素是存在于动植物体内的一种具有广谱抗微生物作用的阳离子多肽［38］，它们可与入侵的革兰阴性和阳性微生物的细胞膜相互作用，一些细菌虽已对它们产生了耐药性，但这些肽经过修改和重新设计可克服这一问题。如D-IK8（MIC：16 μmol·L-1）和WR12（MIC：4 μmol·L-1）等新型合成短肽对MRSA 表现出显著抑制活性。WR12（RWWRWWRRWWRR）是一种完全由色氨酸（Trp）和精氨酸（Arg）组成的12 位氨基酸肽，D-IK8（D-IRIKIRIK-NH2）是一种八残基β-片状肽，两者均可通过破坏细菌细胞膜抑制细菌，导致细胞内容物泄漏，从而导致细菌死亡［39］。研究表明，D-IK8 和WR12 可破坏在体外定植的稳定生长阶段的MRSA。体内研究结果显示，将D-IK8和WR12 应用于MRSA 皮肤感染的小鼠模型时，两者均可显著降低开放伤口内MRSA USA300 的计数，表明D-IK8和WR12在减少MRSA 皮肤损伤的细菌负荷方面非常有效。此外，与传统抗菌药物相比，D-IK8和WR12 在阻断表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌生物膜方面更加有效［39］。

AMP 克服AMR 的能力使其展现出替代传统抗菌药物的潜力。然而，AMP 做为多肽类药物也存在明显局限性，其有限的生物利用度和较弱的蛋白水解稳定性限制了其在临床的广泛应用［40］。为解决这些问题，研究人员以天然AMP为基础进行了优化修饰，以便开发出模拟AMP 特性的合成类似物，修饰的重点是AMP的膜活性及其物理化学性质，如两亲性活性和正电荷。树状多肽是一类新的抗菌药物，是由附着在中心核上的一个功能肽单元的多个副本组成的支化分子，它们表现出抗菌作用［40］。如树状分子RW 4D 通过一种独特的膜溶解作用选择性地消除革兰阴性细菌而非革兰阳性细菌［41］；类似地，树状分子SB056（MIC：3.125 mmol·L-1）对革兰阴性微生物非常有效。研究表明，这些化合物的抗菌活性与多黏菌素B 和黏菌素相当。总之，树状多肽与单体肽相比具有更高的活性，这可能是因为树状多肽具有多价性，所以对蛋白酶和肽酶的蛋白水解活性敏感度降低［40］。

3.3 天然产物

由于传统抗菌药物的耐药形势愈发严峻，研究人员转而对天然抗菌剂产生了浓厚的兴趣。野生植物中感染性疾病的发生率极低，表明这些物种成功地形成了防御机制。研究发现，植物能产生多种小分子（相对分子质量＜500）抗菌剂［42］。此外，自20世纪初以来，天然化合物在治疗微生物引起的感染方面发挥了重要作用，其抗菌特性被多方研究报道［43-44］。

Zhang 等［45］发现来源于唇形科植物Hyptis atrorubensPoit 的粗蕨素是一种强效SrtA 抑制剂，IC50为24.17 μmol·L-1。利用定点诱变技术得到金黄色葡萄球菌SrtA 的2 种突变形式，即Val166Ala和Val168Ala，并评价了粗蕨素对这2 种突变体的抑制活性。结果表明，经粗蕨素抑制后两者活性较天然SrtA 明显降低，较天然SrtA 分别降低了67%和99%。可见粗蕨素是一种可通过靶向SrtA 抑制金黄色葡萄球菌感染的潜在的新型抗菌药物。在Cho 等［46］的相关研究中，对20 种黄酮类化合物的SrtA 抑制性能进行了测试，其中芒柄花素和7-羟-6-甲氧黄酮对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，IC50分别为74.9 和96.1 μmol·L-1。Kim 等［47］的另一项研究发现，葡萄糖甾醇的一种分离物，β-谷甾醇-3-氧-吡喃葡萄糖苷，具有SrtA 抑制作用，IC50为18.3 μg·mL-1。此外，其对金黄色葡萄球菌也具有一定抗菌活性（MIC：200 μg·mL-1），表明该化合物是一种潜在的SrtAi 候选物。该研究还发现，谷甾醇对SrtA 活性和金黄色葡萄球菌均无抑制作用，推断β-谷甾醇-3-氧-吡喃葡萄糖苷的抑制作用取决于吡喃葡萄糖苷侧链部分。

植物产生的小分子抗菌剂大多为弱效抗菌剂，然而不同植物产生的抗菌剂之间可能发生协同作用，合用时抗菌效力有所增强［42］。小檗碱和5-甲氧大风子素的联合作用就是一个典型例子。小檗碱是一种DNA嵌入剂，由于其易被病原菌多药耐药泵排出，因此作为抗菌药物是无效的。而蓝莓的次级代谢产物5-甲氧大风子素是一种多药耐药泵的阻断剂，二者联合作用展现出较强的抗菌作用［42］。

很多种情况下天然化合物和抗菌药物之间同样存在协同作用［48］。mecA基因是编码产生青霉素结合蛋白2a（penicillin binding proteins 2a，PBP2a）的结构基因，由转座子携带并整合至葡萄球菌染色体的mec片段。mec片段是葡萄球菌染色体上获得的外来片段，该片段只存在于耐甲氧西林葡萄球菌中［49-50］。Mun 等［48］通过分析PBP2a 的表达来评估桑色素与β 内酰胺抗菌药物对MRSA 的联合作用。结果显示，单用桑色素的MIC 值为125～500 μg·mL-1，而桑色素与苯唑西林联用的MIC 为0.97～259 μg·mL-1，说明二者之间存在协同作用。桑色素与苯唑西林联用治疗MRSA 时，PBP2a 蛋白水平明显下降，提示该联用方案对MRSA 有出色的临床疗效。根据该研究推测，桑色素联合β-内酰胺抗菌药物展现的杀伤特性可能是通过对抗PBP2a介导的耐药性实现的。Ekambaram等［51］采用琼脂孔扩散法评价迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）对金黄色葡萄球菌和MRSA的抗菌作用。结果表明，RA对金黄色葡萄球菌（MIC：0.8 mg·mL-1）和MRSA（MIC：10 mg·mL-1）均有抑制作用；此外，RA 还与阿莫西林、万古霉素和氧氟沙星对金黄色葡萄球菌有协同抗菌作用，但对于MRSA 的临床分离物，RA仅与万古霉素联用时展现出协同抗菌作用。RA 与这些抗菌药物虽有协同作用，但MIC值仍然较高［51］，临床应用前需进行优化以克服该问题。

4 结语

鉴于超级细菌感染在全球引起的公共卫生危机，人们需要进一步明确细菌生存所需的关键因素和感染进展所需的毒力决定因素，从而有针对性地研发出新型抗菌药物以应对细菌耐药的严峻形势。现有研究表明，针对毒力因子的药物设计是研发新型抗菌治疗的新路线，SrtA 是一种将表面蛋白共价连接到细菌细胞壁的毒力因子，是治疗革兰阳性菌感染的候选靶点。研究人员迄今已筛选出多种具有抗金黄色葡萄球菌活性的SrtAi，如合成小分子、多肽和天然产物，这为攻克革兰阳性超级细菌感染带来了新希望。然而，SrtAi成功应用于临床还面临一些急需解决的难题：①SrtAi 的疗效仍然需要在脓毒症或形成脓肿的体内感染模型中进一步仔细评估；②需要进一步研究SrtAi与其他抗菌剂（如抗菌药物和抗真菌药物）或其他成分的合用，以提高其水溶性或生物利用度，从而降低最终配方中所需化合物的浓度；③SrtAi 应具有良好的成本效益，从而有利于其最终在临床广泛应用；④SrtAi 应在不影响人体内正常微生物菌群恢复下削弱细菌致病性，从而防止超级病菌的发展。综上所述，SrtAi 对金黄色葡萄球菌甚至MRSA 感染展现出一定的临床疗效，尽管仍需优化解决一些问题才能应用于临床，但其为克服AMR 的发展提供了新的研究方向。随着研究的深入推进，SrtAi在未来十分有可能应用于治疗革兰阳性超级细菌感染。