用皮质酮替代饮水小鼠模型评价盐酸羟哌吡酮的抗抑郁效应及机制

房鑫鑫，麻慧，鲍金豪，王川，李云峰，张黎明，聂晶

（1.遵义医科大学基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州遵义 563099；军事科学院军事医学研究院 2.军事认知与脑科学研究所，3.毒物药物研究所，北京 100850；4.河北北方学院研究生院，河北张家口 075000）

随着现代社会竞争的日益激烈，抑郁症等情感性疾病的发病率逐年升高，据WHO 调查，预计到2030 年，抑郁症将成为疾病总负担排名首位［1］。因抑郁症具有高发病、高自杀、高复发、高致残率和低识别、低就诊、低治疗率等特点，目前已成为全球性严重的公共卫生问题和突出的社会问题［1］。目前一线抗抑郁药是基于20 世纪60 年代“经典单胺理论（策略）”研发，普遍存在起效时间延迟（2～6周）、有效率不高（50%～70%）、缺乏认知改善作用甚至损害认知、导致性功能障碍及自杀倾向等明显缺陷，因此发展起效快、副作用低的新型抗抑郁药是目前全球性重大需求和热点。

应激可导致下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）功能亢进，继而引起皮质酮（corticosterone，CORT）水平持续升高，是抑郁症患者常见的生物学异常指标［2］，同时可能也是抑郁症的重要发病机制之一［3］。既往研究证实，长期sc 给予CORT 可导致显著的抑郁样行为［4］，但给药途径繁琐，脂溶性介质引起局部刺激症状显著，且sc 注射的抓取应激对动物行为学结果存在影响，这些缺陷限制了该模型的广泛使用。

本研究在长期sc 给予CORT 致抑郁模型的基础上进行优化，所采用的CORT 半琥珀酸酯（CORT hemisuccinate，CORTH）易溶于水，操作简单。文献报道，氯胺酮可以逆转CORT 替代饮水对小鼠悬尾实验（tail suspension test，TST）中不动时间的增加、蔗糖偏嗜度的降低、高架十字迷宫开放臂进入次数的减少等行为学指标的影响，表现出显著的抗抑郁、抗焦虑样效应，再次验证了该模型的预测有效性［5-6］。

盐酸羟哌吡酮（hypidone hydrochloride，代号：YL-0919）是全新结构的小分子化合物，在多种动物模型上均具有抗抑郁、抗焦虑和促认知效应［7-11］。本研究拟利用改良的CORT 替代饮水致抑郁样模型进一步评价和探讨其抗抑郁效应及可能机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器

YL-0919（批号：D5222-16-1202，纯度99.9%），军事医学研究院毒物药物研究所；盐酸氟西汀（fluoxetine hydrochloride，Flx，批号：F2008083，纯度＞98%），上海阿拉丁生化科技有限公司；CORTH（B2599），美国Steraloids 公司；兔抗小鼠突触后致密蛋白（PSD95）单克隆抗体、兔抗小鼠双皮质素（doublecortin，DCX）多克隆抗体和红色荧光标记山羊抗兔IgG 抗体，美国CST 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 抗体，北京中杉金桥公司。电子分析天平,德国赛托利斯公司；小鼠旷场实验装置、悬尾与强迫游泳实验装置，深圳瑞沃德生命科技有限公司；荧光显微镜，日本奥林巴斯公司；凝胶电泳相关器材，美国伯乐公司。

1.2 实验动物

8周龄雄性C57BL/6小鼠，SPF级，购于北京斯贝福生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2019-0010；小鼠每笼5 只饲养，自由进食饮水，饲养温度20～24℃，湿度40%～60%，12 h黑暗/白昼交替照明（光照时间8∶00～20∶00），适应性饲养14 d后开始实验。动物实验及相关操作获军事医学研究院实验动物伦理委员会批准。

1.3 皮质酮替代饮水小鼠模型的制备

小鼠分为正常对照组和CORT 替代饮水组，实验方案如图1所示。正常对照组小鼠给予正常饮用水，CORT替代饮水组小鼠给予CORTH 25 mg·L-1水溶液。每天同一时间更换新鲜配置的CORTH 溶液，并记录小鼠饮水量［12］。

CORT 替代饮水21 d 后，利用蔗糖偏好实验（sucrose preference test，SPT）验证CORT 替代饮水小鼠模型造模效果，随后将CORT 替代饮水组小鼠随机分为模型组（ig 给予同体积双蒸水）、模型+Flx（10 mg·kg-1，ig）组和模型+YL-0919（1.25，2.5和5 mg·kg-1，ig）组。

1.4 行为学测试

1.4.1 蔗糖偏好实验

分别于给药前和给药第14 天进行SPT。实验开始前进行糖水训练：首先给予小鼠2瓶饮用水，使其自由饮用，适应24 h 后，更换为2 瓶1%蔗糖溶液，再适应24 h。适应结束后，进行小鼠SPT 测试：小鼠禁水16 h（在此期间不限制摄食），之后给予小鼠饮用水和1%蔗糖溶液各1 瓶，称重记录2 h 内小鼠对饮用水及蔗糖溶液的消耗质量。蔗糖偏嗜度=蔗糖溶液消耗质量/（饮用水消耗质量+蔗糖溶液消耗质量）［13］。

1.4.2 旷场实验（open field test，OFT）

连续给药第7 天进行OFT［14］。将小鼠面向实验箱壁放入实验箱（41 cm×41 cm×41 cm，底部均分为16 小格，其上方45 cm 处放置一60 W 灯泡照明），自由活动5 min。采用SMART视频分析软件对小鼠运动距离进行分析，以反映小鼠自发活动，同时对小鼠进入中心区累计停留时间进行统计。

1.4.3 小鼠强迫游泳实验（forced swimming test，FST）

连续给药第8 天进行FST［15］。将小鼠置透明玻璃缸（直径15 cm，高22 cm）中，水温24℃，水深16 cm，每只小鼠游泳6 min，统计后4 min 小鼠累计不动时间。各玻璃缸间均用黑色不透明塑料板遮挡，避免动物相互间视觉干扰。

1.4.4 小鼠悬尾实验

连续给药第9天进行TST［16］。在距离小鼠尾尖约1.5 cm 处，使用胶带将鼠尾固定并悬挂在距离地面50 cm 的悬尾箱中，测试持续6 min，统计后4 min小鼠累计不动时间。

1.4.5 新物体识别实验（novel object recognition test，NORT）

连续给药第11 天进行NORT［17］。实验前2 d 进行适应性训练，在旷场箱内对称位置，放置2 个完全相同的物体，将小鼠按照OFT 放置位置放入箱内进行5 min 自由探索。第2 天进行NORT，将箱内其中1 个旧物体更换为1 个全新物体（颜色、形状、材质均与旧物体不同，但大小与旧物体相似），将小鼠按之前位置放入箱内，自由探索5 min。分别统计小鼠探索新、旧物体的累计时间，计算识别指数。识别指数=新物体探索时间/（新物体探索时间+旧物体探索时间）。

1.4.6 新奇抑制摄食实验（novelty suspended feeding test，NSFT）

连续给药第12天进行小鼠NSFT［17］。小鼠更换垫料并禁食16 h（饮水不限），测试开始前将小鼠置全新安静环境中适应30 min（与小鼠饲养环境及其他测试环境均不同）。在41 cm×51 cm×21 cm 测试箱内铺设约1 cm厚干净垫料，在测试箱内中间位置放置5 粒食丸。测试时将小鼠面向箱壁放入，记录小鼠5 min内第1次摄食的潜伏期。

1.5 免疫荧光检测小鼠海马齿状回DCX阳性细胞数

小鼠行为学检测后，用1% 戊巴比妥钠（50 mL·kg-1，ip）将小鼠麻醉，从左心室经升主动脉先后灌入50 mL 预热（35～37℃）0.9%生理盐水和50 mL 预冷（4℃）4%多聚甲醛溶液。随后取脑，置4%多聚甲醛溶液中，4℃后固定24 h；分别置4℃20%和30%蔗糖溶液中浸泡脱水，用OCT 包埋固定，用冰冻切片机切片，厚度为30 μm，贴片后冻存于-20℃备用。

实验当天，在12 孔板内加入适量PBS（0.01 mmol·L-1），将脑片放入其中，室温振摇漂洗3 次，每次5 min。吸去PBS，加入适量封闭缓冲液，室温轻摇1.5 h。脑片孵育板中每孔加入120 μL 抗DCX 抗体孵育液（1∶800），随后置入脑片，4℃孵育过夜；漂洗3次后加入120 μL二抗孵育液（1∶2000），室温轻摇1.5 h，再次漂洗后封片。使用倒置荧光显微镜观察拍照，使用Image J 软件分析统计海马齿状回DCX阳性细胞数。

1.6 Western 印迹法检测小鼠海马PSD95 蛋白表达水平

小鼠行为学检测后断头取脑并分离海马，置-80℃保存。双侧海马组织加入100 μL冰冻的组织匀浆液，超声研磨器研磨2～3 次，至无肉眼可见块状沉淀，4℃静置30 min 后4℃12 000×g离心10 min，取上清，随后进行蛋白定量及分装。采用10%预制胶进行SDS-PAGE 电泳并恒压转印至PVDF 膜。将PVDF 膜置封闭缓冲液中室温下摇床轻摇1 h；加入一抗（抗PSD95：1∶1000；抗β肌动蛋白：1∶2000），4℃摇床孵育过夜；将PVDF 膜置TBST 中振摇漂洗3 次；之后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 室温孵育1.5 h；再将PVDF 膜置TBST 中振摇漂洗3 次，每次10 min。用化学发光成像分析仪显示蛋白条带；将超敏发光A、B 液按1∶1 比例混合，均匀滴于PVDF 膜上，1 min 后将PVDF 膜转移至凝胶成像系统中曝光成像；用Image J 软件分析蛋白条带积分吸光度值。以目标蛋白与内参蛋白积分吸光度值的比值反映目标蛋白相对表达水平。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 CORT替代饮水小鼠抑郁样模型的鉴定

CORT 替代饮水21 d，小鼠SPT 结果如图2 所示。与正常对照组相比，模型组小鼠蔗糖偏嗜度显著下降（P＜0.01），表现出快感缺失，提示模型组小鼠出现抑郁样行为，CORT 替代饮水小鼠抑郁样模型制备成功。

2.2 YL-0919 对CORT 替代饮水模型小鼠自发活动的影响

YL-0919 连续给药第7 天进行OFT，结果如图3 所示。各组小鼠运动距离均无显著差异，提示CORT 替代饮水模型小鼠自发活动无明显变化，模型+Flx 组和模型+YL-0919 组小鼠自发活动亦无显著变化。

2.3 YL-0919 对CORT 替代饮水模型小鼠抑郁样行为的影响

YL-0919 连续给药第8 和9 天分别进行FST 和TST，结果如图4A和4B所示。与正常对照组相比，模型组小鼠强迫游泳不动时间和悬尾不动时间显著增加（P＜0.01），提示CORT 替代饮水模型小鼠出现抑郁样行为；与模型组相比，模型+YL-0919 1.25，2.5 和5 mg·kg-1组和模型+Flx 组小鼠强迫游泳和悬尾不动时间显著减少（P＜0.01）。

YL-0919 连续给药后第12 天进行NSFT，结果如图5A 所示。与正常对照组相比，模型组小鼠摄食潜伏期明显延长（P＜0.01）；与模型组相比，模型+YL-0919各剂量组和模型+Flx组小鼠摄食潜伏期均明显缩短（P＜0.01）。

YL-0919连续给药后第14天进行SPT，结果如图5B 所示。与正常对照组相比，模型组小鼠蔗糖偏嗜度显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，模型+YL-0919各剂组组与模型+Flx组小鼠蔗糖偏嗜度均明显升高（P＜0.01）。

以上结果提示，YL-0919 可显著逆转CORT 替代饮水诱发的抑郁样行为，具有抗抑郁效应。

2.4 YL-0919 对CORT 替代饮水模型小鼠焦虑样行为的影响

YL-0919 连续给药后第7 天进行OFT，结果如图6 所示。与正常对照组相比，模型组小鼠在旷场中心区累计停留时间明显减少（P＜0.01），提示CORT 替代饮水模型小鼠出现焦虑样行为；与模型组相比，模型+YL-0919 2.5 mg·kg-1组在旷场中心区累计停留时间明显延长（P＜0.01），提示YL-0919可缓解CORT替代饮水模型小鼠的焦虑样行为。

2.5 YL-0919 对CORT 替代饮水模型小鼠认知障碍的影响

YL-0919 连续给药后第10 天进行NORT，结果如图7 所示。与正常对照组相比，模型组小鼠识别指数显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，模型+YL-0919 5 mg·kg-1组小鼠识别指数显著升高（P＜0.05），提示YL-0919 可改善CORT 替代饮水模型小鼠的认知障碍。

2.6 YL-0919 对CORT 替代饮水模型小鼠海马齿状回DCX阳性细胞数和PSD95蛋白表达的影响

如图8所示，与正常对照组相比，模型组小鼠双侧海马齿状回DCX阳性细胞数显著减少（P＜0.05）；与模型组相比，模型+YL-0919 2.5 和5 mg·kg-1组及模型+Flx 组DCX 阳性细胞数显著增加（P＜0.05，P＜0.01）。Western 印迹检测结果（图9）显示，与正常对照组相比，模型组小鼠海马PSD95蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；模型+YL-0919 1.25，2.5 和5 mg·kg-1组及模型+Flx组PSD95蛋白表达水平显著提高（P＜0.05，P＜0.01）。

3 讨论

本研究利用优化的CORT 替代饮水小鼠模型评价YL-0919的抗抑郁效应。结果显示，慢性给予YL-0919 1.25～5 mg·kg-1可明显改善CORT 替代饮水模型小鼠抑郁样和焦虑样行为及认知障碍。进一步机制研究显示，YL-0919 可增加CORT 替代饮水模型小鼠海马齿状回DCX 阳性细胞数和海马PSD95蛋白表达水平，提示YL-0919可能通过改善神经可塑性发挥抗抑郁效应。

FST 和TST 是公认的用于抗抑郁药物评价的实验方法，SPT 可评价抑郁症的核心症状——快感缺失，NSFT 也可广泛应用于抗抑郁药物筛选。本研究在CORT 替代饮水小鼠模型制备成功后，通过上述实验进行行为学评价。结果发现，用CORTH溶液替代正常饮水可诱发持续性抑郁样行为，其行为表现为蔗糖偏嗜度降低及FST 和TST 的不动时间增加，与sc 给予CORT 的行为学变化一致［21-22］。本课题组前期在小鼠NSFT［7，18］、小鼠获得性无助［18］和大鼠慢性不可预知应激［10-19］等抑郁样动物模型上发现，ig 给予YL-0919（1.25～5 mg·kg-1）具有显著的抗抑郁作用。因此，本研究选择同样的剂量评价YL-0919 的抗抑郁作用。研究结果显示，在CORT 替代饮水模型上，慢性给予YL-0919 可显著逆转上述行为表征，进一步证实了YL-0919 的抗抑郁效应。

生理状态下，啮齿类动物肾上腺分泌的CORT直接进入全身血液循环，而外源性补充的CORT（包括饮水或sc给予等）需要通过肝代谢，因此两者对HPA轴的调控作用方式不完全一致。但长期sc、iv 或植入渗透性微型泵等方式操作难度大，易对动物造成创伤或应激［20］。综合考虑上述因素，本研究最终采用CORT 替代饮水模型。正常C57BL/6 小鼠体内CORT的基线水平约为50 μg·L-1［21-22］。在本研究条件下，经检测小鼠饮用CORTH 25 mg·L-1溶液第21 天血液中CORT 浓度在280～340 μg·L-1，这与既往利用慢性社交失败应激构建的小鼠抑郁样模型中血浆CORT 水平（300 μg·L-1）相吻合［21］。本研究采用SPT 检测发现，小鼠CORTH 替代饮水第21天后能诱发抑郁样行为，证实该模型稳定可靠。

本研究YL-0919 部分焦虑样行为实验（NFST和OFT）中，其行为检测结果未表现出典型的剂量依赖关系，这与本实验室以往研究结果一致［7，9-10］。同时，该结果与部分5-羟色胺重摄取抑制类抗抑郁药物在Lancet Psychiatry的荟萃分析结果类似［23］。

神经可塑性是指神经结构和功能的可修饰性，包括突触可塑性、神经元再生、神经网络重新整合和大脑功能区转移等。临床研究表明，抑郁症患者海马体积减小，且减小程度与病程长短、治疗时间以及病情严重程度有关［24-26］。动物实验也发现，慢性应激可导致海马神经元树突复杂度降低、树突棘密度减小［27］，以及海马齿状回神经元新生减少［28］。同时，神经营养因子和5-HT 重摄取抑制剂Flx 均被证明可通过促进海马神经元新生发挥抗抑郁作用［29-30］。DCX 是一种神经元特异性蛋白，在神经元早期有丝分裂过程中促进微管的聚合和稳定。DCX 阳性细胞通常作为神经发生的标志物被广泛用于检测神经元新生。本研究发现，YL-0919 可显著逆转CORT 替代饮水模型小鼠海马齿状回DCX阳性细胞数量降低。PSD95 是兴奋性突触后膜的标志物之一。文献报道，慢性不可预知性应激会导致小鼠海马PSD95 表达水平降低，Flx 长期给药可逆转这一变化［31］。本研究发现，YL-0919 亦可显著逆转CORT 替代饮水模型小鼠海马PSD95 表达下调。

综上，本研究采用CORT 替代饮水小鼠模型发现，YL-0919具有显著的抗抑郁效应，且该效应与提升海马神经可塑性密切相关。本研究为探索YL-0919的抗抑郁作用机制提供新的实验依据。