奥贝胆酸联合白藜芦醇对小鼠非酒精性脂肪性肝病的治疗作用

高川，姚宜山，周奎臣，付海洋，王金柱，梁霞霞，王瑜

（1.佳木斯大学临床医学院，黑龙江佳木斯 154007；2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，北京 100850；3.长治医学院药学院，山西长治 046000）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）包括单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）和肝硬化，严重者可发展为肝细胞癌［1］。目前全球25%的人患有NAFLD［2］，并随生活水平的提高NAFLD患病率持续上升［3-4］。奥贝胆酸（obeticholic acid，OCA）是一种法尼醇X 受体（farnesoid X receptor，FXR），能够调节脂质和葡萄糖代谢的转录因子，主要作用是通过抑制编码胆固醇7α-羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）的细胞色素P450 基因表达和提高胆汁酸转运蛋白表达而减少胆汁酸［5］。此外，OCA 可有效降低NAFLD 患者脂肪变性，改善肝组织纤维化［6］，但其低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）和总胆固醇（total cholesterol，TC）升高，高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）降低，增加心血管疾病风险等问题较为突出［7-8］。白藜芦醇（resveratrol，RSV）是一种抗衰老、抗氧化、抗炎和胰岛素敏感的天然多酚化合物，对过氧化氢诱导的细胞凋亡有抑制作用［9］，可缓解炎症刺激、氧化应激及细胞凋亡等产生的肝损伤［10］。另外，可通过调节脂代谢升高HDL、降低LDL 而降低心血管疾病风险［11］，还可降低肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，增加超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，减少心肌梗死面积而发挥对心肌梗死的治疗作用［12］。本研究旨在探索OCA与RSV 联用对NAFLD 的治疗作用及其可能的作用机制，以期为OCA 联合RSV 治疗NAFLD 提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和主要仪器

OCA，纯度98%，厦门海乐景生化有限公司；白藜芦醇，纯度98%上海迈瑞尔化学技术有限公司；SOD 和MDA 测试盒，南京建成生物工程研究所；谷丙转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）、谷草转氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）、甘油三酯（triglycerides，TG）、TC、HDL 和LDL 检测试剂盒，美国贝克曼库尔特有限公司；白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒，上海炫雅生物科技有限公司；兔抗小鼠沉默信息调节因子1（sirtuin 1，Sirt1）、NF-κB 和磷酸化NF-κB（p-NF-κB）单克隆抗体（一抗）及IRDye 800CW 荧光标记山羊抗兔IgG 抗体（二抗），美国Cell Signaling Technology 公司；紫外可见分光光度计（型号UV-26001），津岛仪器（苏州）有限公司；全自动生化分析仪（型号AU5800），美国贝克曼库尔特有限公司；多功能微孔板读板机（型号Spectra Max i3x），美国Molecular Devices公司。

1.2 动物、NAFLD模型制备和分组

42 只SPF 级雄性C57BL/6N 小鼠〔许可证号：SCXK（京）2016-0006〕，6周龄，体重16～18 g，北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠自由饮水和进食，定期更换垫料，在环境安静、温度23～25℃、相对湿度40%～60%和12 h昼夜交替条件下饲养。小鼠随机分为正常对照组（8 只）和建模组（34 只），建模小鼠每周1 次ip 给予1% 四氯化碳（CCl4）5 mL·kg-1，同时饲喂高脂饲料（由15%猪油、2.8%胆固醇、0.28%甲硫氧嘧啶、0.7%胆酸钠和81.2%普通饲料组成），持续28 d。随机选取2 只小鼠，处死后观察肝体积略增大，包膜紧张光滑，边缘变钝，质地柔软，色黄，有油腻感；切片观察有大量脂滴视为NAFLD 模型制备成功。将建模小鼠随机分为模型组、模型+RSV 组、模型+OCA 组和模型+OCA+RSV 组，OCA 和RSV 均30 mg·kg-1（参考文献［13］），每组8 只；每天ig 给药1 次，连续给药28 d；正常对照组和模型组ig 给予等体积0.5%羧甲纤维素钠混悬液。

1.3 样本制备

给药28 d 后，禁食不禁水12 h，次日对各组小鼠称量体重，处死后取血于1.5 mL 离心管中，制备血清，-20℃冰箱中保存。取肝并称重，于肝左叶切取2块5 mm×5 mm×5 mm 肝组织，4%多聚甲醛固定，其余-80℃冻存。

1.4 计算肝指数

据1.3 体重和肝重计算肝指数。肝指数=肝重（g）/体重（g）×100。

1.5 HE染色观察肝组织病理变化

取1.3 制备的肝组织，经石蜡固定、HE 染色后于200倍镜下观察炎症细胞浸润、脂肪空泡、纤维化和组织结构的变化。

1.6 油红O染色观察肝组织脂质沉积和脂滴面积

取1.3 制备的肝组织，OCT 包埋，冰冻切片，进行油红O 染色，吸水纸吸干水分后甘油明胶封片。油红O 染色后脂肪呈红色，正常肝组织显示青蓝色。于显微镜镜下（×200）观察肝细胞内脂肪变化，并用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0定量分析脂滴面积。脂滴面积百分比（%）=红色脂滴覆盖面积/总测量面积×100%。

1.7 全自动生化仪检测血清GPT，GOT，TG，TC，HDL和LDL水平

取1.3 制备的血清，用全自动生化仪检测小鼠血清GPT，GOT，TG，TC，HDL和LDL水平。

1.8 检测血清SOD活性和MDA含量

取1.3 制备的小鼠血清，按试剂盒说明书检测血清SOD活性和MDA含量。用紫外分光光度仪分别于550和532 nm波长检测各孔吸光度值。

1.9 ELlSA检测血清lL-1β，lL-6和TNF-α含量

取1.3 制备的血清，用ELISA 试剂盒检测血清IL-1β，IL-6和TNF-α含量。

1.10 Western 印迹法检测肝组织Sirt1，NF-κB 和p-NF-κB蛋白水平

取1.3 冻存肝组织，各组称取50～100 mg 提取总蛋白，用BCA 法进行蛋白定量。取等量蛋白，加入等体积上样缓冲液，混匀后99℃恒温金属浴10 min。每孔上样15 μL，80 V，电泳30 min，再用120 V 电压电泳100 min。冰浴，200 mA 电流，转膜100 mim。按1∶500 稀释一抗，4℃孵育过夜；按1∶5000 稀释二抗，室温孵育120 min。以目标蛋白和内参蛋白积分吸光度值比值表示目标蛋白相对表达水平。

1.11 统计学分析

2 结果

2.1 奥贝胆酸与白藜芦醇联用对NAFLD 模型小鼠肝指数的影响

表1结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠肝指数明显升高（P＜0.01）。与模型组相比，模型+OCA 组、模型+RSV 组和模型+OCA+RSV 组小鼠肝指数明显降低（P＜0.01）。与模型+RSV 组相比，模型+OCA+RSV组肝指数明显降低（P＜0.05），但与模型+OCA 相比，其肝指数降低不明显。表明OCA与RSV联用比RSV单用可更有效降低肝指数。

Tab.1 Effect of obeticholic acid（OCA）combined with resveratrol（RSV）on liver indexes of model mice with non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）

2.2 奥贝胆酸与白藜芦醇联用对NAFLD 模型小鼠肝组织病理变化的影响

HE染色结果如图1显示，正常对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞排列整齐，无炎症细胞浸润，细胞无脂变。模型组肝小叶界限不清，肝细胞索排列紊乱，出现弥漫性脂肪变性，可见大小不等、数量不一的脂滴空泡。模型+OCA 组和模型+RSV 组肝小叶不清晰，肝细胞形态大致正常且大小较一致，部分肝细胞轻度水样变性，脂滴空泡减少。模型+OCA+RSV 组肝小叶清晰，肝细胞大小较一致且形态正常，脂滴空泡减少，脂质沉积程度减轻。

2.3 奥贝胆酸与白藜芦醇联用对NAFLD 模型小鼠肝细胞中脂质沉积的影响

如图2A 所示，正常对照组小鼠肝细胞几乎无红染，无脂变。模型组小鼠肝细胞内脂滴被染成红色，大小不一，广泛分布在胞质中，提示大量肝细胞内存在脂质沉积。模型+OCA 组和模型+RSV 组小鼠肝细胞内红色脂滴减少，脂质沉积程度有所减轻。模型+OCA+RSV 组肝细胞内红色脂滴减少，脂质沉积程度减轻。如图2B 所示，与正常对照组相比，模型组脂滴面积百分比明显升高（P＜0.01）。与模型组相比，模型+OCA 组、模型+RSV 组和模型+OCA+RSV 组脂滴面积百分比明显降低（P＜0.01）。与模型+RSV 组相比，模型+OCA+RSV组脂滴面积百分比明显减低（P＜0.01）。

2.4 奥贝胆酸与白藜芦醇联用对NAFLD 模型小鼠肝功能和血脂的影响

由表2 可知，与正常对照组相比，模型组血清GPT，GOT，TG，TC 和LDL 水平明显升高，HDL 水平明显降低（P＜0.01），提示模型小鼠发生肝损伤和血脂紊乱。与模型组相比，模型+OCA 组血清GPT，HDL 和LDL 水平变化均不明显，GOT，TG 和TC 水平明显下降（P＜0.05）；模型+RSV 组血清GPT，GOT和HDL水平变化不明显，TG，TC和LDL水平明显下降（P＜0.01）；模型+OCA+RSV 组血清GPT，GOT，TG，TC 和LDL 水平均明显下降（P＜0.01），HDL 水平明显升高（P＜0.01）。与模型+OCA 组相比，模型+OCA+RSV 组GPT，TC 和LDL水平明显降低（P＜0.05，P＜0.01），HDL 水平明显升高（P＜0.01）。与模型+RSV 组相比，模型+OCA+RSV组GPT和GOT水平明显降低（P＜0.05，P＜0.01），HDL水平明显升高（P＜0.05）。

2.5 奥贝胆酸与白藜芦醇联用对NAFLD 模型小鼠血清SOD活性和MDA含量的影响

由表3可知，与正常对照组相比，模型组小鼠血清SOD 活性明显降低，MDA 含量明显升高（P＜0.01），提示模型小鼠肝组织发生氧化应激。与模型组相比，模型+OCA 组SOD 活性明显升高（P＜0.01），MDA 含量下降（P＜0.05）；模型+RSV 组SOD 活性明显升高（P＜0.01）；模型+OCA+RSV 组SOD 活性明显升高，MDA 含量明显下降（P＜0.01）。与模型+OCA 组和模型+RSV 组相比，模型+OCA+RSV 组SOD 活性变化不明显，但MDA 含量明显降低（P＜0.01）。表明两者联合用药比两者单用具有更好的抗氧化应激作用。

Tab.2 Effect of OCA combined with RSV on levels of serum glutamic pyruvic transaminase（GPT）, glutamic oxaloacetic transaminase（GOT）, triglyceride（TG），total cholesterol（TC），high-density lipoprotein（HDL）and lowdensity lipoprotein（LDL）of model mice with NAFLD

Tab.3 Effects of OCA combined with RSV on serum superoxide dismutase (SOD)activity and malondialdehyde(MDA)content of model mice with NAFLD

2.6 奥贝胆酸与白藜芦醇联用对NAFLD模型小鼠血清lL-1β，lL-6和TNF-α水平的影响

由表4可知，与正常对照组相比，模型组小鼠血清IL-1β，IL-6 和TNF-α 水平明显增加（P＜0.01）。与模型组相比，模型+OCA 组IL-1β 水平变化不显著，IL-6和TNF-α水平明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；模型+RSV 组IL-1β，IL-6 和TNF-α 水平明显降低（P＜0.01）；模型+OCA+RSV组IL-1β，IL-6和TNF-α水平均明显降低（P＜0.01）。与模型+RSV 组相比，模型+OCA+RSV 组IL-6 水平明显降低（P＜0.01）。与模型+OCA 组相比，模型+OCA+RSV 组IL-1β 和IL-6明显降低（P＜0.01）。

Tab.4 Effect of OCA combined with RSV on serum interleukin-1β（lL-1β），lL-6 and tumor necrosis factor-α（TNF-α）levels of model mice with NAFLD

2.7 奥贝胆酸与白藜芦醇联用对NAFLD模型小鼠肝组织Sirt1，NF-κB和p-NF-κB蛋白表达水平的影响

由图3可知，与正常对照组相比，模型组肝组织Sirt1 蛋白表达水平明显降低，NF-κB 和p-NF-κB 表达水平明显增加（P＜0.01）。与模型组相比，模型+OCA组Sirt1，NF-κB和p-NF-κB蛋白表达水平无明显变化；模型+RSV 组Sirt1 蛋白表达水平明显增加（P＜0.01），NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；模型+OCA+RSV 组Sirt1 蛋白表达水平明显增加（P＜0.01），NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01），且p-NF-κB 蛋白表达水平较模型+OCA组明显降低（P＜0.05）。

3 讨论

本研究结果表明，OCA 与RSV 联用可降低NAFLD 模型小鼠血清MDA 水平，同时Sirt1 蛋白表达水平升高，NF-κB 表达水平降低，IL-6，IL-1β 和TNF-α 分泌降低。有研究表明，细胞内抗氧化剂的消耗和炎症反应在NAFLD 形成中具有重要作用，是对肝“二次打击”的主要形式，随后肝细胞死亡和细胞凋亡，促使NAFLD 向NASH 进展［14］，过氧化产物MDA 含量可体现细胞受氧自由基损伤程度［15］。NF-κB是至关重要的核转录因子，促进炎症因子IL-6，IL-1β 和TNF-α 分泌［16］。高脂饮食可激活NF-κB，升高肝组织IL-6，IL-1β 和TNF-α 水平［17］。Sirt1 是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性酶［18］，Sirt1 可使NF-κB 亚基去乙酰化，并抑制其转录活性［19］，减少炎症因子分泌，抑制炎症对NAFLD 的肝损伤，而阻止从NAFLD 进展为NASH。本研究结果表明，OCA 与RSV 联用清除体内MDA 能力增加，减轻肝脂质过氧化，提高抗氧化能力，同时增加Sirt1 表达并抑制NF-κB 激活，提示OCA 与RSV 联用可能通过Sirt1/NF-κB 途径减少IL-6，IL-1β 和TNF-α 等炎症因子分泌，降低NAFLD 氧化应激对肝“二次打击”和炎症因子对肝的损伤。

本研究结果表明，OCA 与RSV 联用在改善NAFLD 组织和血清指标的同时，可更显著降低TC和LDL 水平，升高HDL 水平，与前期相关研究结果［20］一致。有研究表明，OCA 在降低NAFLD 患者肝脂肪水平时，血清LDL 和TC 升高，HDL 降低，从而使心血管疾病风险增加［8］。TC 增加会导致动脉硬化，诱发心血管疾病，可作为准确预测心血管风险的指标［20-21］，同时HDL降低和LDL升高也是心血管疾病发病的重要因素［22］。本研究结果表明，OCA与RSV 联用还改善了OCA 在脂蛋白和血脂调节能力的不足，从而降低了OCA 单用时TC 和LDL 升高、HDL降低导致的心脑血管等风险。

综上所述，OCA 与RSV 联用可提高抗氧化应激能力，并通过调节Sirt1 和NF-κB 蛋白表达及NF-κB 活化减少炎症因子分泌，从而减轻NAFLD模型小鼠肝损伤，阻止NAFLD 进一步发展；还可调节血脂和脂蛋白，降低OCA单用带来的心血管疾病风险。本研究结果为OCA 与RSV 联用治疗NAFLD提供了实验依据。