续断种子方对少精子症大鼠睾丸SPAG6表达的影响

陈 六,郑翼驰,陈 露,王权胜

(1. 广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530001；2. 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

少精子症是男性不育症的重要影响因素之一，近年来该病发病率较高。前期临床研究发现续断种子方治疗少弱精子症疗效显著，有效率高达80.3%[1]；实验研究发现续断种子方在精子发生发育过程中起调控作用，不仅能有效促进精子的发生发育，更能显著提高生精细胞氧化损伤修复能力，可有效修复睾丸氧化损伤[2-5]。精子相关抗原6(sperm-associated antigen 6, SPAG6)作为一种参与精子发生发育的重要蛋白，有研究表明其在弱精子症患者精子中表达量明显下降[6]；且SPAG6缺失可造成野生雄性小鼠精子成长发育不全，导致小鼠不育[7]。基于上述研究基础，本实验探讨了续断种子方对少精子症模型大鼠睾丸组织中SPAG6表达的影响，以期为后续临床及实验研究提供基础与思路。

1 实验材料与方法

1.1主要实验仪器 WLJY-9000型伟力彩色精子质量检测系统(北京伟力新世纪科技发展有限公司)，EG1150H+C型石蜡包埋机(德国Leica公司)，Finesse E+型半自动轮转切片机(美国ThermoShandon公司)，BX43型光学生物显微镜(日本Olympus公司)，半干式转移电泳槽(JUNYI公司)，全自动化学发光/荧光图像分析系统(上海天能)，台式冷冻离心机(德国eppendorf )，涡旋混合器(江苏省金坛市荣华实验器材有限公司)，酶标仪 (BioTek Epoch)，电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，荧光定PCR仪(德国AnalytikJena公司)。

1.2主要实验试剂 4%聚氯甲醛，苏木精-伊红染液，动物组织总RNA提取试剂盒(天根)，HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (诺维赞)，抗β-actin抗体(生工公司，生产批号：D110001)，抗SPAG6抗体(abcam公司，生产批号：ab155653)，蛋白裂解液(碧云天)，BeyoECL Plus ECL化学发光试剂盒(碧云天)，兔抗SPAG6多隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司，生产批号：bs-12291R)。

1.3主要实验药物 环磷酰胺(Baxter公司，注册证号H20160467，规格：200 mg)，左卡尼汀口服溶液(大连美罗中药厂有限公司，国药准字H20103448，规格：10 mL∶1 g)，续断种子方颗粒(由续断15 g、骨碎补15 g、杜仲15 g、牛膝15 g、菟丝子15 g、枸杞子10 g、女贞子10 g、党参15 g、白术10 g、山药15 g组成，免煎中药,江苏省江阴市天江药业有限公司,产品批号：1203002)。

1.4实验动物及分组 45只SPF级SD雄性大鼠, 6～8周龄，体重240～250 g,湖南安生美药物研究有限公司提供，动物许可证号：SCXK(湘)2019-0004。实验动物饲养于广西中医药大学第一附属医院动物实验房，自由采光，喂养环境温度22～25 ℃，饲料及饮用水喂养1 d/次，垫料更换3 d/次。

1.5实验方法 大鼠适应性喂养1周后，随机取11只作为空白组(造模期间腹腔注射生理盐水)，余34只参考文献[8]方法建立少精子症模型：200 mg环磷酰胺中加入10 mL生理盐水稀释后，以100 mg/kg剂量持续腹腔注射7 d，然后随机取4只大鼠检测精子质量，若精子浓度及活力明显低于空白组，则提示造模成功。将造模成功的30只大鼠随机分为模型组、续断种子方组及左卡尼汀组，每组10只。续断种子方组予续断种子方溶液10 g/kg灌胃，左卡尼汀组予左卡尼汀口服溶液100 mg/kg灌胃，空白组及模型组予等量生理盐水灌胃，均1次/d，持续8周。喂养过程中，左卡尼汀组死亡1只。

1.6取材方法 末次灌胃并禁食24 h后将各组大鼠以颈椎脱臼法处死，开腹取出双侧睾丸及附睾并分离游离脂肪等。

1.7检测指标及方法

1.7.1精子质量检测 将获取的各组大鼠附睾组织放于5 mL清洁量杯中剪碎，37 ℃恒温水浴箱中充分游离后，采用精子计数板及精子检测系统进行精液分析，参考第5版《WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册》[9]对精子质量进行评估。

1.7.2睾丸组织HE染色观察 取各组大鼠部分睾丸组织，于4%聚氯甲醛中固定后，进行脱水、埋蜡、切片、苏木精伊红染色处理，光学显微镜下观察。

1.7.3睾丸组织SPAG6蛋白表达免疫组化观察取各组大鼠部分睾丸组织，加入Anti-SPAG6抗体，常规制备石蜡切片后，免疫组化法观察各组大鼠睾丸组织中SPAG6蛋白表达情况。

1.7.4睾丸组织SPAG6蛋白表达Western blot检测 将各组大鼠部分睾丸组织研磨粉碎置于1.5 mL EP管中，加入10倍体积蛋白裂解液进行裂解，然后离心、煮沸变性，提取SPAG6总蛋白，进行SDS-Page胶电泳检测蛋白浓度及质量，电泳后对样本转膜封闭。取封闭膜在TBST(3次，10 min)和TBS(1次，10 min)中进行震荡洗涤(频率80次/min)后加入一抗，在4 ℃下孵育过夜；孵育后以前法2次震荡洗涤加入二抗，室温孵育1 h；3次震荡洗涤后在膜上滴加化学发光液在成像系统进行曝光成像。SPAG6蛋白相对表达量=SPAG6蛋白/β-actin。

1.7.5睾丸组织SPAG6 mRNA实时荧光定量PCR检测 使用天根《动物组织总RNA提取试剂盒》，严格按照操作说明提取各组大鼠睾丸组织SPAG6总RNA，以1.2%琼脂糖凝胶电泳30 min检测RNA完整性后，对总RNA进行反转录获取cDNA；以cDNA为主体加入引物、SYBR Green Master Mix和无酶水等制备混合反应溶液，对其进行预热、PCR循环以及溶解曲线；完成上述步骤后，将加样的Array孔板置于荧光定量PCR仪中进行反应检测。引物序列：SPAG6上游引物5’-GCTGAGACCTCTTCTTCTGGAT-3’,下游引物5’-CCTTCACAACTGCTTCTGCTAA-3’，产物110 bp；GAPDH上游引物5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’,下游引物5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’，产物92 bp。各组SPAG6 mRNA的相对表达量以2-ΔΔct表示，ΔΔct=(目标基因CT-目标内参基因CT)-(空白基因CT-空白内参基因CT)。

2 结 果

2.1各组大鼠精子质量比较 模型组大鼠精子浓度及活力均明显低于空白组(P均<0.05)；续断种子方组、左卡尼汀组大鼠精子浓度及活力均明显高于模型组(P均<0.05)，且续断种子方组均明显高于左卡尼汀组(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组和少精子症各组大鼠精子浓度及活力比较

2.2各组大鼠睾丸组织HE染色情况 空白组生精上皮形状规则，厚度正常；生精小管饱满且有序密集排列，腔内可见大量精子细胞；各生精上皮间充斥大量间质细胞。模型组生精上皮严重变形，厚度变薄；生精小管杂乱干瘪，且数量减少，腔内仅可见少量成型精子细胞；间质细胞明显减少。左卡尼汀组及续断种子方组较模型组情况明显改善；续断种子方组与左卡尼汀组相比，生精上皮更加规则有序，生精小管相对密集，精子细胞及间质细胞更加丰富。见图1。

图1 空白组和少精子症各组大鼠睾丸组织HE染色表现(×200)

2.3各组大鼠免疫组化染色睾丸组织中SPAG6蛋白表达情况 空白组大鼠睾丸生精小管、生精上皮、精子细胞中可见密集黄褐色SPAG6蛋白表达；模型组可见少量SPAG6蛋白表达；左卡尼汀组及续断种子方组SPAG6蛋白表达较模型组明显增加，且续断种子方组较左卡尼汀组多。见图2。

图2 空白组和少精子症各组大鼠睾丸组织中SPAG6蛋白表达情况(免疫组化染色，×400)

2.4各组大鼠睾丸组织中SPAG6蛋白表达情况模型组大鼠睾丸组织中SPAG6蛋白相对表达量明显低于空白组(P<0.05)；续断种子方组、左卡尼汀组大鼠睾丸组织中SPAG6蛋白相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，且续断种子方组明显高于左卡尼汀组(P<0.05)。见图3和图4。

图3 空白组和少精子症各组大鼠睾丸组织中SPAG6蛋白及内参表达条带

图4 空白组和少精子症各组大鼠睾丸组织中SPAG6蛋白相对表达量

2.5各组大鼠睾丸组织中SPAG6 mRNA表达情况模型组大鼠睾丸组织中SPAG6 mRNA相对表达量明显低于空白组(P<0.05)；续断种子方组、左卡尼汀组大鼠睾丸组织中SPAG6 mRNA相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，续断种子方组与左卡尼汀组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

图5 空白组和少精子症各组大鼠睾丸组织中SPAG6 mRNA相对表达量

3 讨 论

现有数据显示，在众多不孕不育家庭中，男性因素占比高达50%[10]。男性不育症病因复杂，临床以精索静脉曲张、内分泌失调及精子异常较为多见，其中精子异常就包括少精子症。第5版《WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册》[9]指出：精子总数(或浓度)低于39×106(15×106/mL)即为少精子症。

环磷酰胺临床上多用于免疫系统疾病冲击治疗，其代谢副产物丙烯醛有强毒性及强氧化能力，能够损伤男性精子总量及活力，致使少无精子症的发生[11]。环磷酰胺损伤睾丸生精功能作用机制尚未明确，实验研究中少精子症模型动物的制备多使用小鼠，但有研究显示环磷酰胺可通PP2A和β-catenin信号通路损伤大鼠睾丸组织，导致大鼠精子质量的下降[12]，因此本实验参考相关文献，以环磷酰胺影响大鼠睾丸生精功能制备少精子症模型。HE染色观察发现，模型组大鼠较空白组大鼠生精上皮、生精小管明显变质，管腔内成形精子细胞、间质细胞明显减少，提示环磷酰胺可用于大鼠少精子症模型的建立。

左卡尼汀别名左旋肉碱，广泛存在于人体组织及血浆中，其中附睾中表达量最高[13]。有研究显示，左卡尼汀直接参与精子的发育过程，与精子的活力及浓度密切相关，附睾组织左卡尼汀的缺失可能直接导致少弱精子症的发生；同时附睾微环境的氧化应激反应也会导致精子形态异常，进而引发男性不育[14-15]。左卡尼汀作为目前临床治疗男性不育症的常规用药，对少弱精子症、畸形精子症及生殖系统炎症所致男性不育均有独特疗效，其不仅为精子发育成熟提供必不可少的能量[16]，更能提高附睾抗氧化能力[17]，为精子发生发育提供安全稳定的微环境。本研究中，左卡尼汀组大鼠精子浓度及活力明显高于模型组，再次验证了左卡尼汀提高精子质量的有效性及对少精子症的适用性。

少精子症在古代相关文献中涉及较少，可归为“精少”“精清”“精冷”等范畴。古今各家大多认为其病位在肾，与肝、脾密切相关，主要病机可归为肾虚夹痰、湿、瘀、滞等[18]。《素问·玉机真藏论》：“脾为孤藏，中央土以灌四傍，脾精之浓厚者化营化血，轻清者化卫化气。”《素问·六节藏相论》“肾者，主哲封藏之本，精之处也”，即肾藏父母所赋先天之精与脾胃所化后天之精，脾失所化，则营气不从，肾无所藏，则肾精亏虚。治当健脾益肾、活血生精。续断种子方出自明医岳甫嘉所书《医学正印》：“补肾健脾益气种子煎方”，其认为脾所化精神气血，乃生精种子之生息之源，此方生精最速，辅以适当禁欲，更能得子。续断种子方中续断、骨碎补、杜仲、牛膝、菟丝子、枸杞子、女贞子、山药均有补肾生精之功，续断、骨碎补兼有活血通经之效，党参、白术及山药则能健脾养血，诸药合用，共奏生精种子之力。现代药理学研究显示，杜仲、菟丝子、牛膝、枸杞子、骨碎补、女贞子、党参中含有丰富的天然黄酮类化合物，如槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、山柰酚等，具有抗氧化、抗炎及调控细胞凋亡等作用[19-22]。 续断、杜仲、骨碎补、菟丝子、牛膝、枸杞子、女贞子中则含有丰富的β-谷甾醇(天然多酚羟酸类化合物)，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和神经保护作用[23]。本实验结果显示，续断种子方组大鼠精子浓度及活力均高于模型组和左卡尼汀组，大鼠睾丸生精上皮、生精小管及精子细胞损伤情况较模型组明显改善，且改善情况明显优于左卡尼汀组。提示续断种子方能有效提高少精子症模型大鼠精子质量。

SPAG6最早是研究男性不育的克隆基因[24]，后被归为癌睾丸抗原家族，其高表达于睾丸、附睾组织及肿瘤组织中，参与精子运动、发育及肿瘤的形成，具有蛋白调节及交互作用功能[25]。相关研究显示：SPAG6定位于圆形精子顶体，能与丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPINK2)、T复合体相关睾丸表达3 (TCTE3)和COP9信号复合体亚基5(COPS5)相互作用，调控精子发生发育过程[7，26-27]。本实验结果显示，续断种子方组、左卡尼汀组睾丸组织中SPAG6蛋白及mRNA表达量均明显高于模型组，且续断种子方组SPAG6蛋白表达量明显高于左卡尼汀组。证明SPAG6参与精子发生发育过程，续断种子方可能通过调控SPAG6表达影响少精子症模型大鼠精子质量。

综上，环磷酰胺适用于少精子症模型大鼠造模；SPAG6参与精子发生发育过程，续断种子方可能通过调控SPAG6表达而提高少精子症模型大鼠精子质量，为少精子症的治疗提供了新的作用靶点，后续可深入研究SPAG6及其相互作用蛋白与少精子症的关系，为少精子症的研究提供更多新思路。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。