两种扇贝杂交和自交子一代生长性状的比较

陈 洋，赵春暖，蔡忠强，王晓梅，郑言鑫，于 涛

(中国水产科学研究院 长岛增殖实验站，山东 烟台 265800)

虾夷扇贝 (Patinopectenyessoensis)原产于日本，于1982年引入中国，并迅速在山东、辽宁等地区进行养殖，是我国重要的养殖贝类之一[1]。经过多年的养殖，虾夷扇贝大规模死亡现象频发，长海县作为我国最大的虾夷扇贝增养殖基地[2]，每年虾夷扇贝死亡造成的经济损失就达10亿元[3]。研究表明，虾夷扇贝大规模死亡除了受悬浮物、高温刺激等极端环境因素影响外[4-5]，种质退化、高密度养殖、环境变化、病原侵袭等也是我国虾夷扇贝死亡的主要原因[6-7]。其中种质退化导致虾夷扇贝自身抵抗环境、病原的能力下降，因此培育性状优良的品种是解决虾夷扇贝死亡的途径之一。

杂交育种是培育新品种的一种传统、有效的育种方法，是改良遗传性状、培育优良品种的可靠途径。在贝类中，相关学者陆续开展了扇贝[8-10]、牡蛎[11-14]、鲍[15-19]等养殖品种种内、不同地理群体、种间等的杂交育种试验，所得杂交种在成活率、生长速度和抗逆性等方面显示出了良好的生产性状和一定的杂种优势。

杨爱国等[20-21]分别开展了栉孔扇贝(Chlamysfarreri)(♀)×虾夷扇贝(♂)的远源杂交研究，杂交后代表型性状偏向母本，但在生长速度和抗逆性方面表现出一定的杂种优势，促进了栉孔扇贝养殖业的健康发展。笔者以虾夷扇贝为母本、栉孔扇贝为父本进行杂交选育，分析子一代个体生长、存活情况，探究杂交子代推广的价值，以期改善虾夷扇贝种质，提高其生长、存活和抗逆能力，保障虾夷扇贝养殖业的健康可持续发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

虾夷扇贝选自长岛南隍城海域人工养殖群体，壳高(10.45±0.48) cm；栉孔扇贝选自胶南人工养殖群体，壳高(6.73±0.32) cm。

1.2 试验时间和地点

亲本暂养、杂交及幼虫培育试验在中国水产科学研究院长岛增殖实验站内进行；稚贝暂养及养成在长岛南隍城海域进行。

1.3 试验设计

设计4个试验组合：虾夷扇贝♀×虾夷扇贝♂(虾夷扇贝自交组合)、虾夷扇贝♀×栉孔扇贝♂(正交组合)、栉孔扇贝♀×栉孔扇贝♂(栉孔扇贝自交组合)、栉孔扇贝♀×虾夷扇贝♂(反交组合)。

1.4 试验方法

1.4.1 亲贝暂养

采用浮动网箱暂养，暂养密度30～50个/m3；前期每日倒池1次，后期每日早、晚各换水1次，每次换水1/3；饵料和升温方式为：虾夷扇贝采用自然水温暂养，投喂三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)，经过至少2次严格的挑选后将雌体和雄体分开；栉孔扇贝采用逐步升温的方法进行暂养促熟，饵料以三角褐指藻为主，搭配球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)和螺旋藻(Spirulina)进行营养强化，经过至少2次严格的挑选后将雌体和雄体分开。

1.4.2 产卵、受精、孵化

性腺充分发育成熟后，再次确认同一群体无雌雄混杂。采用阴干、升温、间断充气的方法诱导虾夷扇贝、栉孔扇贝雌体在池中产卵，同时将虾夷扇贝、栉孔扇贝雄体分别放于2个玻璃缸水槽中排精。将精、卵混合受精后，每个卵子周围有3～4个精子，连续取样观察胚胎发育情况，直到发育至D形幼虫。

1.4.3 幼虫培育

当80%受精卵发育至D形幼虫，立即用虹吸法选优进行培养。培育适宜密度为8～12个/mL；光照低于500 lx；饵料以球等鞭金藻为主，日投喂量为1.5×104～5.0×104个/mL，日投喂3～6次；日换水2次，每次换水1/2，每5 d倒池1次；培育水温：虾夷扇贝自交组、正交组培育水温16 ℃，栉孔扇贝自交组、反交组培育水温19 ℃。

培育期间，每日检测试验组幼虫生长情况，包括壳高、密度等，以确定其生长速度和成活率。

1.4.4 附着基投放

当幼虫眼点率达到30%～40%时，投放附着基。

1.4.5 稚贝暂养及养成

将附有稚贝的附着基放入60目网袋中，垂挂于海区的浮绠上，壳长达0.3 cm时分入20目网袋中，稚贝壳长约1 cm时装入扇贝笼养殖，完成稚贝的海区中间培育。

1.5 数据分析

受精率、孵化率、幼虫生长及存活中的相关数据计数使用生物显微镜(重庆奥特B204LED)。稚贝及成贝的壳高测量使用游标卡尺。

各指标计算公式如下：

R1=n2/n1×100%

(1)

R2=n4/n3×100%

(2)

R3=n6/n5×100%

(3)

R4=n8/n7×100%

(4)

式中，R1为受精率(%)，n1为所有卵子数(个)，n2为出现第一极体的卵子数(个)，R2为孵化率(%)，n3受精卵数(个)，n4为孵化出的D形幼虫数(个)，R3为幼虫期存活率(%)，n5为第1天的幼虫数(个)，n6为测量日存活的幼虫数(个)，R4为稚贝期存活率(%)，n7为挂入海区的稚贝总数(个)，n8为测量日存活稚贝数(个)。

幼虫期，于第1、3、5、7、9、12、15、18、20天取样，每组每次取样30个个体，于显微镜下测量壳长，并统计存活率。

稚贝海区中间培育及养成期，于1月龄至8月龄，每月每组取样30个个体，并在11月龄分苗、15月龄收获时分别取样，测量壳高，并统计存活率。

用Excel软件对各试验数据进行整理，采用SPSS 19.0软件统计分析软件进行单因素方差分析及邓肯多重比较，结果用平均值±标准差形式表示。

2 结 果

2.1 受精率、孵化率比较

自交、杂交组合均可完成受精过程，受精率为97.19%～98.15%；自交组合略高于杂交组合，以虾夷扇贝为母本的组合略高于以栉孔扇贝为母本的组合，但单因素方差分析及邓肯多重比较结果显示，相互之间差异不显著(P>0.05)(表1)。

自交、杂交组合的孵化率也较高，为89.09%～92.76%；自交组合略高于杂交组合，以栉孔扇贝为母本的组合略高于以虾夷扇贝为母本的组合，但单因素方差分析及邓肯多重比较结果显示，组合间差异不显著(P>0.05)(表1)。

表1 各组合的受精率和孵化率 %

2.2 幼虫期生长和存活情况比较

孵化后至7日龄时，幼虫规格无显著差异(P>0.05)；9日龄开始幼虫生长差异逐渐显现出来，杂交组合明显快于自交组合(表2、图1)。

以栉孔扇贝为母本的组合，栉孔扇贝自交、反交组合在15日龄时投放附着基，反交组合的眼点幼虫平均规格为196.27 μm，而栉孔扇贝自交组合的眼点幼虫的规格为189.20 μm，杂交组合较自交组合大3.74%；栉孔扇贝自交、反交组合的生长日平均增长量为5.76、6.28 μm/d，杂交组合较自交组合提高9.03%。

以虾夷扇贝为母本的组合，虾夷扇贝自交、正交组在20日龄时投放附着基。正交组合的眼点幼虫平均规格为263.10 μm，而虾夷扇贝自交组合的眼点幼虫的规格为252.20 μm，杂交组合较自交组合大4.32%；虾夷扇贝自交、正交组合的生长日平均增长量为8.16、8.57 μm/d，杂交组合较自交组合提高5.02%。

表2 幼虫期各组合生长情况 μm

图1 幼虫期不同组合生长情况Fig.1 Growth at different larval stages in different combination

幼虫阶段，栉孔扇贝自交、反交组合的存活率分别为63.09%、64.83%，相互之间差异不显著(P>0.05)；虾夷扇贝自交、正交组合存活率相对较高，分别为70.07%、69.16%，但相互之间差异不显著(P>0.05)(表3、图2)。

2.3 附着变态率和海区保苗率的比较

栉孔扇贝自交、反交组在15日龄时投放附着基，虾夷扇贝自交、正交组合则在20日龄时投放附着基，4个组合幼虫均在一周内完成附着变态过程。虾夷扇贝自交、正交组合变态率较栉孔扇贝自交、反交组合高，其中虾夷扇贝自交附着变态率最高，达48.28%，栉孔扇贝自交、反交组合变态率约为45%(表4)，但单因素方差分析及邓肯多重比较结果显示相互之间差异不显著(P>0.05)。

表3 幼虫期各组合存活率情况 %

表4 各组合附着变态率与海区保苗率情况 %

以栉孔扇贝为母本的栉孔扇贝自交、反交组合的海区保苗率明显高于以虾夷扇贝为母本的虾夷扇贝自交、正交组合，其中栉孔扇贝自交、反交组合的保苗率分别为60.59%、61.25%，相互间差异不显著(P>0.05)，虾夷扇贝自交、正交组合的海区保苗率分别为31.17%、36.3%，杂交组合显著高于自交组合，提高5.13个百分点。

2.4 养成期生长和存活情况比较

生长至8月龄时，栉孔扇贝自交、反交组合的壳高分别达到33.49、35.97 mm(表5、图3)，组合间差异显著且杂交组合较自交组合生长速度提高7.41%；8月龄时，栉孔扇贝自交、反交组合生长月增长量为4.70、5.05 mm/月，组合间差异显著且杂交组合较自交组合月增长量提高7.45%。

生长至15月龄时，虾夷扇贝自交、正交组合的壳高分别达到64.30、75.47 mm(表5、图3)，组合间差异显著且杂交组合较自交组合生长速度提高17.37%；15月龄时，虾夷扇贝自交、正交组合生长月增长量明显较高，为4.55、5.34 mm/月，组合间差异显著且杂交组合较自交组合月增长量提高17.36%。

表5 养成期各组合生长情况 mm

第一次分苗时，栉孔扇贝自交、反交组合的存活率分别为87.42%、89.35%，组合间差异不显著(P>0.05)；第二次分苗时，栉孔扇贝自交、反交组合的存活率分别为82.69%、87.45%，杂交组合显著高于自交组合(表6)。反交组合总的存活率为78.14%，栉孔扇贝自交组合总的存活率为72.29%，杂交组合较自交组合提高5.85个百分点。

第一次分苗时，虾夷扇贝自交、正交组合的存活率分别为96.44%、98.50%，组合间差异不显著(P>0.05)；第二次分苗时，虾夷扇贝自交、正交组合的存活率分别为87.57%、92.22%，杂交组合显著高于自交组合；第三次分苗时，虾夷扇贝自交、正交组合的存活率分别为81.23%、89.45%，杂交组合显著高于自交组合；第四次分苗时，虾夷扇贝自交、正交组合的存活率分别为71.07%、82.66%，杂交组合显著高于自交组合。整个养成期间，正交组合的总存活率为67.16%，而虾夷扇贝自交组合的存活率为48.75%，杂交组合较自交组合提高18.41个百分点。

表6 不同时期各组合存活率情况 %

3 讨 论

3.1 虾夷扇贝与栉孔扇贝杂交的可行性

虾夷扇贝和栉孔扇贝为扇贝科扇贝属的两个不同种，二者染色体同为2n=38条[22-24]，这就为二者进行远缘杂交提供了可能。周丽青等[25-27]研究表明：在染色体数目上，虾夷扇贝和栉孔扇贝正、反交子代早期胚胎的染色体数目为38条，与其双亲一致；在染色体构成上，绝大部分正、反交子代分别继承了栉孔扇贝和虾夷扇贝各一套染色体，为真正的杂交种。本研究表明，二者正反交均可进行，后期杂交子代均可正常生长，这也与杨爱国等[20-21]的研究结果一致。

3.2 远缘杂交对受精率、孵化率的影响

本试验中，4个组合的受精率均在97%以上，组合间差异不显著(P>0.05)，这也与杨爱国等[20-21]的研究结果一致。刘桂龙等[28]研究虾夷扇贝与风向标扇贝(P.caurinus)种间杂交时发现，杂交组合的受精率与自交组合有显著差异；而南乐红等[29]在紫扇贝(Argopectenpurpuratus)与墨西哥湾扇贝(A.irradiansconcentricus)杂交的研究中发现，杂交组的受精率与自交组差异不显著(P>0.05)，甚至部分杂交组的受精率和孵化率高于自交组。这些研究结果与陈来钊等[30]的观点一致，即父母本亲缘关系的远近一般与受精无直接的联系。

通常，孵化率的高低取决于卵子的成熟度，对杂交胚胎来说，还取决于双亲之间差异的程度，即亲和性大小[30]。吕振明等[27]研究表明，栉孔扇贝与虾夷扇贝杂交子代中两套染色体具有较强的亲合性，与杂交子代具有较高的孵化率结果吻合。

3.3 子代性状表现

杨爱国等[20]研究表明，虾夷扇贝(♀)×栉孔扇贝(♂)的杂交子一代仅表现出存活率优势，生长速度差异不显著(P>0.05)。于瑞海等[21]研究表明，虾夷扇贝(♀)×栉孔扇贝(♂)的杂交子一代表现出一定的生长优势，而成活率则差异不显著(P>0.05)。

本试验结果显示：虾夷扇贝(♀)×栉孔扇贝(♂)的杂交子一代在幼虫期的存活率未表现出显著性差异(P>0.05)，但在9日龄后表现出一定的生长优势；附着变态率虽然无显著差异(P>0.05)，但海区保苗率提高5.13个百分点；在养成阶段，杂交子一代表现出明显的杂种优势，生长速度提高了17.37%。

3.4 远缘杂交对子代存活率的影响

存活率是良种选育的另一个重要指标，存活率的高低反映了子代对环境的适应能力，对最终产量也有很大的影响[31]。杂交除了对子代生长速度有一定的影响，子代间的存活率也存在一定的差异。杨爱国等[20]研究表明，虾夷扇贝(♂)×栉孔扇贝(♀)的杂交子一代的存活率在夏季高温季节明显提高；郑怀平等[32]研究表明，两个海湾扇贝(A.irradians)养殖群体杂交组的存活率都高于相应的自交组；丰玮等[33]研究表明，紫扇贝与海湾扇贝杂交后代的存活率显著高于自交组。关于贝类远缘杂交的研究也表明，杂交种不一定全部具有杂种优势，杂交过程中会出现配子不兼容、幼虫存活率低和幼虫不变态等远交衰退现象[34]。张跃环等[35]进行的长牡蛎(Crassostreagigas)与近江牡蛎(C.ariakensis)种间杂交结果表明，在存活率方面，以长牡蛎为母本的杂交组具有显著的优势，而反交组则表现为劣势。本研究结果表明，幼虫期各组合的存活率和附着变态率无显著差异(P>0.05)，而养成期反交、正交组合的存活率较栉孔扇贝自交、虾夷扇贝自交组合分别提高5.85、18.41个百分点，杂交组合表现出明显的杂种优势。

4 结 论

笔者建立了虾夷扇贝、栉孔扇贝自交、杂交组合，比较了每个组合的生长和存活性状，结果显示，正反交组合较自交组合均具有一定的杂种优势，且虾夷扇贝(♀)与栉孔扇贝(♂)杂交获得的子一代杂种优势更加显著。虽然杂交子一代外部形态与虾夷扇贝相同，但显著提高了虾夷扇贝的生产性能，远缘杂交育种是解决虾夷扇贝大面积死亡的重要途径之一，正交子一代已经具有生产使用价值，适于大面积推广，提高虾夷扇贝养殖的良种覆盖率和养殖效益。