斑点叉尾肠道及其养殖环境菌群结构分析

熊向英，赵艳飞,2，王志成

(1.广西海洋研究所有限责任公司，广西 北海 536000；2.广东海洋大学 水产学院 甲壳动物遗传育种与增养殖实验室，广东 湛江 524088)

鱼类肠道中存在着由大量细菌构成的微生物群落，是动物长期进化的结果。宿主为肠道菌群提供了栖息生存环境，肠道微生物则对宿主的免疫、健康、营养等有积极的影响[5]。鱼类肠道菌群组成及平衡状态与机体健康密切相关，如肠道微生物中的益生菌具有免疫刺激因子的作用，通激免疫器官发育、促进淋巴细胞免疫功能，进而提高机体的免疫水平[6]。同时养殖环境中存在大量有益微生物类群，这些微生物类群参与养殖系统的物质循环和水质调节，能直接影响养殖动物的健康状况[7-8]。

1 材料与方法

1.1 养殖管理和水质检测

试验在广西合浦县党江镇南域村叉尾鱼科技扶贫示范基地开展，养殖池塘面积约0.67 hm2，水深约1.3 m，放苗约4.2万尾，养殖时间自8月初至次年7月底。每日早晚2次投喂漂浮性颗粒配合饲料，投喂量约为鱼体质量的3%。养殖期间每隔2个月采用多功能水质分析仪YSI professional series测定池塘水温、pH、溶解氧含量。采用TA-90紫外可见分光光度计(深圳市清时捷科技有限公司)测定氨氮和亚硝态氮含量。

1.2 样品采集

试验样品采于2019年7月，分别收集成鱼肠道和养殖水体2类样品。随机捕捞成鱼3尾，平均体长30.1 cm，平均体质量294 g，样品标记为N1～N3。采集水样时池塘一周未换水，养殖水体取3个点，分别用有机玻璃采水器在池塘对角线两侧离岸1.5 m处及正中间位置采集水样，每个点取样1 L，分别标记为W1～W3。

1.3 样品DNA提取、PCR扩增及高通量测序

1.4 数据分析

使用FLASH 1.2.11软件对原始测序序列进行拼接，使用Trimmomatic 0.33软件将拼接得到的序列进行质量过滤，并用UCHIME 8.1软件去除嵌合体，得到高质量序列(Tags)。分析过程中删除了古菌、叶绿体、未知序列以及只检测到1次的序列。

1.4.1 运算分类单元聚类和物种注释

利用USEARCH 10.0软件对所有样品的高质量序列进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为运算分类单元，参考SILVA的SSUrRNA数据库对其进行物种注释分析。

1.4.2 多样性分析

通过Alpha多样性分析，统计各样品在97%相似性水平下的Ace、Chao1、Shannon及Simpson指数，绘制样品稀释曲线和等级丰度曲线，研究单个样品内部的物种多样性。

1.4.3 功能基因预测

将测序数据经过Greengenes database 13.8数据库比对后生成得运算分类单元表, 根据其16S rDNA拷贝数划分的每个运算分类单元丰度将其均一化，通过PICRUSt预测微生物表型，如氧耐受、革兰氏染色、致病潜力等。

2 结果与分析

2.1 养殖池塘水质指标

养殖期间池塘水质指标见表1，水温、pH和溶解氧质量浓度(除2018年11月)均保持在稳定状态。到养殖后期，池塘的氨氮和亚硝态氮质量浓度明显升高，但均维持在较低水平。

表1 斑点叉尾池塘养殖水质指标

2.2 肠道和水环境中菌群的多样性

表2 各样品Alpha多样性指数统计

等级分布曲线在横轴的跨度表示样品中细菌多样性的丰富程度，在纵轴的平滑程度反映样品中细菌分布的均匀程度。水体样品细菌多样性高于肠道，而肠道中则存在相对丰度明显占优的细菌种类(图1)。

图1 各样品中细菌多样性的等级分布曲线Fig.1 Rank-abundance curves based on the OTU species number in each sample

2.3 肠道和水环境中菌群的相关性分析

图2 肠道和水体中细菌数目的韦恩分析Fig.2 Venn analysis of bacterial number in intestine and pond water

2.4 微生物群落分析

图3 基于门水平的样品细菌相对丰度Fig.3 Relative abundance of phylum-level bacterial communities in different samples

图4 样品菌群在属水平上的细菌相对丰度Fig.4 Relative abundance of genus-level bacterial communities in different samples

2.5 细菌表型的预测

3 讨 论

3.1 斑点叉尾肠道和养殖水体菌群多样性和相关性分析

图5 Bugbase预测细菌群落表型分析Fig.5 Bugbase prediction of bacterial community phenotype3条线自下而上分别代表下四分位、平均值和上四分位.The three lines represent the lower quartile, mean and upper quartile from bottom to top, respectively.

3.2 斑点叉尾肠道优势菌群分析

3.3 斑点叉尾肠道和水体菌群表型预测

4 结 论