西藏新鲜牦牛肉风干过程中微生物种类 及数量变化动态研究

◎ 朱艳妮，布 穷，张志德，马红梅

（西藏大学 理学院，西藏 拉萨 850000）

风干牦牛肉是藏族人民重要的日常食物之一，是以生鲜牦牛肉为原料在低温阴凉通风处阴干或冻干制成的，其传统的制作方法是把牦牛肉切割成条状，一条一条挂在阴凉处，让其自然风干。由于其风味独特，贮存期长，是一种备受消费者青睐的传统肉制品。牛肉经冷冻风干过程加工后，水分含量低、体积小、质量轻，保持了牛肉原有营养价值和固有风味[1]。通过定期测定风干过程中牦牛肉自身的pH值，得出上述理化因子的变化和牦牛肉在风干过程中微生物的种类和数量的变化之间是否存在相关性，以期通过控制理化因子的变化来抑制微生物的生长繁殖，避免牦牛肉在风干过程中由微生物引起的腐败变质问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5 kg市售西藏生鲜牦牛肉，市售；PCA（Plate Count Agar）培养基、PCA+（改进型PCA）培养基、MRS（De Man，Rogosa，Sharpe Agar）培养基、MRS+（改进型MRS）培养基和VJ（Vogel Johnson Agar）培养基，西藏建成生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

ESCO超净工作台（上海博迅实业有限公司）、DK-8D恒温水浴锅（上海佑科仪器仪表有限公司）、JA3003N电子天平、Memert IPP110恒温培养箱、ZEALWAY高压灭菌锅、Panasonic MPR-210医用冷藏箱、INFORS Multition Standard摇床（无锡市华科仪器仪表有限公司）、Alalis PC320酸度计、Sartorius G-16C高速冷冻离心机、VELP ZX4型振荡器（郑州生元仪器有限公司）、DHG-2200B电热鼓风干燥箱、ESCO S-4S1生物安全柜、Panasonic MDF-682医用低温箱、Panasonic MDF-339医用低温箱、Biometra P25 T电泳仪、Biometra TADVANCED 846-x-070-280 PCR仪及Analytik jena M-26XV凝胶成像系统。

1.3 实验方法

1.3.1 实验设计

实验分别于鲜肉、风干2 d、风干5 d、风干7 d、风干10 d、风干15 d和风干20 d取样，每次取3个重复。分别检测样品菌落总数、微球菌、乳酸菌、乳酸杆菌及葡萄球菌数量的变化，鉴定实验风干过程的优势菌种，并测定其pH值、温度。

1.3.2 风干牦牛肉的制备

购入5 kg市售西藏生鲜牦牛肉，将其切割成一条条的肉条，悬挂在绳子上，进行风干，置于拉萨室内自然环境下，避光通风风干。

1.3.3 微生物指标的测定

采用稀释平板法测定微生物数量，在无菌条件下称取25.0 g样品，加入225 mL 0.9%无菌生理盐水，充分进行搅拌，使其充分混匀。取1 mL上清液于含有9 mL 0.9%无菌生理盐水的试管中，进行加倍递增稀释，分别稀释至10-3、10-4、10-5，每个稀度做3个平行，用培养基培养[2]。不同的菌群分别采用不同的选择性培养基进行分离和计数。

菌落总数的测定：用PCA培养基在30 ℃培养48 h测定细菌总数；微球菌数的测定：用PCA+（改进型PCA）培养基在30 ℃培养48 h测定微球菌；乳酸菌数的测定：用MRS（De Man Rogosa Sharpe Agar）培养基在30 ℃培养48 h测定乳酸菌；乳杆菌数的测定：用MRS+（改进型MRS）培养基在30 ℃培养48 h测定乳杆菌；葡萄球菌数的测定：用VJ培养基（Vogel Johnson Agar）在30 ℃培养48 h测定葡萄球菌[3]。

1.3.4 理化指标的测定

取风干过程的牦牛肉，分别于鲜肉、风干2 d、风干5 d、风干7 d、风干10 d、风干15 d和风干20 d进行取样，每次取3个重复。将牦牛肉干切碎置于烧杯中，用穿刺型pH计测定样品的pH值，记录，结果取3次测定的pH平均值。

1.4 数据处理

每个样品进行3次重复试验，并使用SPSS 26软件进行t检验，P＜0.05表示差异显著，然后使用Origin软件绘图。

1.5 优势种鉴定

1.5.1 取样并纯化

实验分别从鲜肉、风干2 d、风干5 d、风干7 d、风干10 d、风干15 d和风干20 d中取样，每次取3个重复，将上述制成的稀释液接种于PCA+培养基、MRS培养基、MRS+培养基、VJ培养基，在各培养基中分别取数目最多、重复最高的菌落数纯化，得到纯化的单菌株。

1.5.2 16S rDNA鉴定细菌

（1）DNA的提取。将菌体放入离心管中，加入50 µL的DNA提取液，10 µL的二氧化硅晶体，放入离心机中，离心（4 ℃，10 000 r·min-1，5 min），取上层清液于管中，放入4 ℃冰箱里保存30 min后取出，在65 ℃水浴锅里水浴1 h，然后置于-20 ℃冰箱里保藏。

（2）PCR扩增（16S rRNA序列的扩增）。16S rRNA基因的扩增使用细菌通用引物27F和1459R。16S rRNA基因正向引物27F核酸序列（5’-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3’）和反向引物1495R核酸序列（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）。PCR 体系 50 µL 内 含 模 板 DNA（100 ng·µL-1）2.0 µL、27F（20 pmoL·µL-1）2.0 µL、1495R（20 pmoL·µL-1）2.0 µL、Premix-Taq酶25 µL和超纯水25 µL；扩增条件：94 ℃下模板变性5 min，随后94 ℃下变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环结束后4 ℃保存。PCR结束后，DNA在1%（W/V）琼脂糖凝胶（Promega）中电泳。

（3）在凝胶成像仪上观察。电泳结束后用100 mg·mL-1溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）溶液浸泡凝胶10 min，回收溴化乙锭溶液，用蒸馏水冲洗凝胶后在紫外光（凝胶成像仪）下观察，PCR产物为1 500 bp的条带。

（4）送检。将样本送至生工生物工程（上海）股份有限公司鉴定。

2 结果与分析

2.1 新鲜牦牛肉风干过程中的微生物指标变化

2.1.1 新鲜牦牛肉风干过程中细菌总数的变化

由图1可知，牦牛肉风干过程中细菌总数均呈现升高趋势，但菌落总数均没有超过30 000 CFU·g-1，符合熟肉制品卫生标准[4]。在鲜肉到风干5 d之间均没有显著性差异，在风干5 d与风干7 d之间存在显著性差异，在风干7 d与风干10 d之间存在显著性差异，而风干10 d到风干20 d之间不存在显著性差异。

图1 新鲜牦牛肉风干过程中细菌总数变化图

2.1.2 新鲜牦牛肉风干过程中微球菌数的变化

由图2可知，牦牛肉风干过程中微球菌数呈现先下降后升高的趋势。实验初期，微球菌为优势菌种，数量较多，但随新鲜牦牛肉的风干，微球菌数量下降，但下降不显著。随pH值上升，乳酸菌和乳酸杆菌对其抑制作用减弱，微球菌数量上升。

图2 新鲜牦牛肉风干过程中微球菌数变化图

2.1.3 新鲜牦牛肉风干过程中乳酸菌数的变化

由图3可知，牦牛肉风干过程中乳酸菌数基本上呈升高趋势。在整个风干过程中，乳酸菌一直是优势菌，能产生细菌素，抑制有害微生物的生长，显著提高产品的安全性[5]。在鲜肉与风干5 d无显著性差异，而在鲜肉到风干2 d有显著性差异，风干2 d到风干5 d有显著性差异。

图3 新鲜牦牛肉风干过程中乳酸菌数变化图

2.1.4 新鲜牦牛肉风干过程中乳酸杆菌数的变化

由图4可知，牦牛肉风干过程中乳酸杆菌数均呈升高趋势。在整个风干过程中，乳酸杆菌一直是优势菌，可以抑制各种腐败和致病细菌增长。鲜肉到风干5 d无显著性差异，风干5 d到风干7 d有显著性差异，风干7 d到风干10 d有显著性差异，风干10 d到风干15 d有显著差异，而风干15 d到风干20 d无显著性差异。

图4 新鲜牦牛肉风干过程中乳酸杆菌数变化图

2.1.5 新鲜牦牛肉风干过程中葡萄球菌数的变化

由图5可知，牦牛肉风干过程中葡萄球菌数基本呈上升趋势。随着风干的进行，葡萄球菌数量因乳酸菌产酸的影响有所下降，之后由于水分含量的降低，乳酸菌数量减少，葡萄球菌耐受性增加，导致葡萄球菌数量回升[6]。

图5 新鲜牦牛肉风干过程中葡萄球菌数变化图

2.2 新鲜牦牛肉风干过程中的pH变化

由图6可知，pH值在7 d前呈上升趋势，在7 d和15 d之间呈下降趋势，但总体来说pH值是呈上升趋势的，家畜刚被宰杀时的肉处于等电点，其pH值为5.3～5.5[7]。pH值从实验初始5.355升至实验中段6.055，然后降至实验后期5.935，最后上升至6.205。在肉制品的生产过程中，提高肉制品pH值，可以增加肉制品的系水性[8]。由此可知，实验pH值升高，可能与肉制品系水性提高相关。实验后期，乳酸菌、微球菌占据微生物菌群的主导地位，乳酸菌产酸，使肉制品的pH下降；微球菌也可以降低pH，控制病原微生物和腐败微生物的生长[9]。

图6 新鲜牦牛肉风干过程中pH值变化图

2.3 优势菌种鉴定结果

在实验初期的优势种为清酒广泛乳杆菌（Latilactobacillus sakei）、弯曲乳酸杆菌（Latilactobacillus curvatus）、魏森特普山假单胞菌（Pseudomonas weihenstephanensis）、乳酸乳球菌亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）、马葡萄球菌（Staphylococcus equorum）、短波单胞菌属（Brevundimonassp.）；在实验中期的优势种为清酒广泛乳杆菌（Latilactobacillus sakei）、魏森特普山假单胞菌（Pseudomonas weihenstephanensis）、多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium multivorum）；在实验后期与末期的优势种为清酒广泛乳杆菌（Latilactobacillus sakei）、弯曲乳酸杆菌（Latilactobacillus curvatus）、琥珀酸葡萄球菌亚种（Staphylococcus succinussubsp.succinus）。

3 结论

新鲜牦牛肉风干过程中细菌总数均没有超过国家标准，可以安全食用。细菌总数及微球菌、乳酸菌、乳杆菌、葡萄球菌呈上升趋势，细菌总数及乳酸菌、乳杆菌数目较高。优势细菌以乳酸菌、乳杆菌为主，其次为假单胞杆菌、葡萄球菌，以及少量的鞘氨醇杆菌、单胞菌属。

（2）新鲜牦牛肉风干过程中pH变化基本上呈上升趋势，pH为5.35～6.23，其pH值波动或与乳酸菌、微球菌使牦牛肉pH值下降，与肉制品系水性提高使pH升高有关。

（3）清酒广泛乳杆菌（Latilactobacillus sakei）的代谢产物如细菌素和肽聚糖可以抑制致病或腐败细菌。在整个实验期间，为优势种。清酒广泛乳杆菌（Latilactobacillus sakei）对牦牛肉风干过程中腐败微生物起抑制作用。弯曲乳酸杆菌（Latilactobacillus curvatus）可以在牦牛肉风干过程的初期与后期起到抑制各种腐败菌和致病菌增长的作用。这两种菌或在牦牛肉风干过程中有效抑制了致病菌及腐败菌的增殖，为保持牦牛肉风干过程中的安全性及可食用性提供了切实的保障。