甘松浸膏超声波萃取工艺的响应面法优化

包秀萍，刘煜宇，连培康，徐兰兰，念小魁

(1.云南瑞升烟草技术(集团)有限公司，云南 昆明 650106，2.江西中烟工业有限责任公司，江西 330096)

甘松为败酱科植物NardostachysjatamansiDC.的根及茎[1].是受国家保护的藏药之一，常用来作为藏医、中医的药材[2-4].甘松含有大量的挥发性萜类成分如倍半萜类、三萜类、环烯醚萜类等[5-9].近年来，有研究报道，甘松的化学成分主要采用水蒸气蒸馏萃取获得挥发油，将其用于医药临床的抗菌、镇静等方面的研究[10]，而在香精香料领域的研究较少.甘松具有独特的药草香、木香和凉香，因此，开发甘松香料浸膏在香精香料行业具有较高的应用价值和广泛的前景.

前人针对甘松的研究主要集中在不同产地甘松原料分析和挥发油的化学成分分析，主要验证石油醚萃取、水蒸气蒸馏得到的挥发油在医药中的应用研究，但是关于甘松用于制备香料浸膏的研究较少[11-12].文中采用超声波辅助萃取法[13-18]对甘松进行乙醇萃取，利用超声波空化效应高效富集甘松中的醇溶性组分，提高萃取率.并通过响应面法[19-22]对萃取工艺进行优化，运用GC-MS检测方法[23-27]检测萃取物中的成分.为开发具有独特香韵的甘松香料浸膏提供参考，拓宽甘松在香料领域的应用.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

试剂及原料：甘松(昆明地道中药饮片厂)，95%酒精、丙二醇(食品级)，二氯甲烷(AR-天津市博迪化工有限公司)，无水硫酸钠(AR-广东汕头市西陇化工厂).

试验仪器：超声波辅助萃取设备(哈尔滨申宜科技有限公司)；SHZ-3型循环水真空泵，控温加热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)，GC/MS(HP 6890/5973)分析仪(美国Agilent公司)，同时水蒸气蒸馏溶剂萃取装置(SDE)(实验室自制)，旋转蒸发仪(Heidolph OB2000)(德国Heidolph公司).

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备

称取粉碎的甘松原料，按照响应面实验设计条件进行超声波辅助萃取，萃取液合并，减压浓缩即得甘松浸膏.

1.2.2 响应面法实验设计

利用Box-Behnken Design (BBD)进行响应面法设计，以超声功率A(W)、萃取时间B(min)和乙醇体积分数C(%) 3个因素为自变量，每个因素取3个水平，以-1, 0和+1编码，以甘松浸膏的萃取率为响应值进行因素水平设计(表1).

萃取得率计算公式为：

甘松浸膏的得率(%)=甘松萃取物质量(g)/原料质量(g)×100%.

表1 实验因素水平编码

1.2.3 同时蒸馏萃取

取 25 g 甘松浸膏放入同时蒸馏萃取装置一端的 500 mL 圆底烧瓶中，并加入 2 mL 内标物萘(质量浓度 100 μg/mL)，加入 250 g水后用电热套加热回流，装置的另一端为 100 mL 圆底烧瓶，里面装有 25 mL 二氯甲烷，在 60 ℃ 水浴中加热同时蒸馏萃取 2 h.用无水硫酸钠作为干燥剂对二氯甲烷萃取液进行干燥，置于 4 ℃ 条件下放置，二氯甲烷过滤后将滤液倒入浓缩瓶中用Vigreux柱浓缩至约 1 mL，浓缩液用于GC/MS分析备用.

1.2.4 GC/MS分析条件

毛细管柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：240 ℃；载气：He，1 mL/min；程序升温：升温至 50 ℃ 保持 1 min，以 8 ℃/min 升温至 160 ℃保持 2 min,继续以 8℃/min 升温至 260 ℃ 保持 15 min；进样量：0.5 μL，分流比：25∶1；传输线温度：280 ℃；电离方式：EI，电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：160 ℃；质量范围35～455 aum.按照方法TCJC-ZY-Ⅳ-014-2012进行检测，采用NIST14、Wiley275质谱谱库检索测定分析.

2 结果与讨论

2.1 响应面实验结果及分析

2.1.1 响应面实验结果

按照响应面法的Box-Behnken Design(BBD)实验方案进行实验，结果见表2所示.

上述方案的15个实验点包括12个析因点(1～12)和3个中心点(13～15)，中心点重复是为了估计整个实验的纯误差，以甘松浸膏的得率Y作为响应面分析的响应值.

2.1.2 响应面实验结果分析

对表2进行多元回归拟合后，得到甘松浸膏得率(Y)对超声功率(A)、萃取时间(B)和乙醇体积分数(C)的二次多项回归方程模型为：

Y=-36.851 42+0.123 10×A+0.379 87×B+1.009 33×C+2.250 00E-004×A×B-3.062 50E-004×A×C+1.400 00E-003×B×C-1.004 17E-004×A2-7.826 67E-003×B2-5.729 17E-003× C2

表2 工艺优化试验方案与结果

续表2

上述的二次回归方程方差分析结果和回归方程系数显著性检验结果见表3所示.3因素交互作用对甘松得率的响应面分析结果见图1～6所示.

表3 回归方程模型的方差分析结果

图1 超声功率-萃取时间对得率的等值线图 图2 超声功率-萃取时间对得率的响应面分析

图3 超声功率-乙醇体积分数对得率的等值线图 图4 超声功率-乙醇体积分数对得率的响应面分析

图5 萃取时间-乙醇体积分数对得率的等值线图 图6 萃取时间-乙醇体积分数对得率的响应面分析

由表3数据和图1～6可以看出，所得的模型极显著(P<0.01)，失拟项不显著，说明未知因素对实验结果干扰很小.模型的决定系数R2为 0.994 3(>0.9)，说明该模型能够分析甘松浸膏得率的响应值变化.模型与实际情况拟合较好，适用于分析和预测超声波辅助萃取甘松浸膏的实际情况.

由表3可知，一次项A,B和C差异极显著(P<0.01)，二次项A2、B2和C2均达极显著水平(P<0.01) ，说明超声功率、萃取时间和乙醇体积分数对甘松得率有极显著的影响.交互项AB、AC达极显著水平(P<0.01)，BC差异显著(P<0.05)，说明3因素交互作用对甘松浸膏得率有显著的影响.

2.1.3 验证实验

为深入验证模型的可靠性，对最优方程条件：超声功率 500.00 W、萃取时间 40.00 min、乙醇体积分数80.67 %(为便于应用，实际超声波功率 500 W、萃取时间 40 min、乙醇体积分数80%)进行3次实验.

由表4可知，经过3次实验验证，甘松浸膏得率的平均值为42.3%，与优化后的回归方程得到的预测值43.2%相近，表明该模型可靠，适用于响应面法优化超声波萃取甘松香料浸膏工艺.

表4 验证实验

2.2 样品致香成分检测结果和分析

由表5和图7可知，经过超声波辅助萃取，能够有效富集甘松中的主要致香成分，经GC-MS检测出甘松香料浸膏有67种成分，其中含量最高的是异戊酸(1 880.351 μg/g)，其次是百秋李醇(932.805 μg/g)，此外含量超过 300 μg/g 的是喇叭烯氧化物-(Ⅱ)(606.377 μg/g)、(+)-γ-古芸烯(533.779 μg/g)、(-)-斯巴醇(498.844 μg/g)、(+)-香橙烯(319.35 μg/g)、白菖烯(313.182 μg/g).

表5 甘松浸膏致香成分分析

续表5

图7 甘松浸膏致香成分总粒子流图

3 结果与讨论

通过响应面法优化得到的模型可靠，甘松香料浸膏的最佳超声波萃取工艺为：超声波功率 500 W、萃取时间 40 min、乙醇体积分数80%.通过超声波辅助进行乙醇萃取，能够有效富集甘松中的主要成分，其中含量最高的是异戊酸，该成分具有浓烈的气息，经过高度稀释后具有甜润的果香，可用于食用香料(奶酪、水果香精)、医药制造(生产镇静催眠药物)、烟用香料(存在于白肋烟和香料烟中可改善香烟品质)；其次是具有木香和膏香气息的百秋李醇(用于制药、保健品、烟用香料)和古芸烯(用于镇定熏香、香料调配)；以及具有凉香气息的(-)-斯巴醇(用于制药、香料)、蓝桉醇(生产香料)、白菖烯(用于制药、香料).

前人研究主要以非极性溶剂或蒸馏法制备得到挥发油，以白菖烯、异长叶烯为主要成分，研究其在医药中的作用.而本文以极性溶剂体系制备甘松香料浸膏，获得以异戊酸、百秋李醇为主要成分的制备方法，所制备得到的甘松浸膏具有独特的药草香、木香香韵特征，在食品、日化、香烟中可以赋予特殊的香韵风格，打破甘松主要在医药临床方面的应用，为甘松的广泛应用奠定基础.