流苏石斛乙醇提取物的化学成分研究

刘莎莎,李红锐, 孙静贤，王瑞生，邵金良，刘宏程, 黄相中, 李艳红

(1.云南民族大学 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南 昆明 650504；2.云南省农业科学院 质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650205)

流苏石斛(DendrobiumfimbriatumHook.)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生草本植物，多生长于疏松的厚树皮或树干上.目前，野生的流苏石斛资源非常少，主要依赖人工栽培，是一种深受人们喜爱的观赏性花卉，主产于云南、贵州、广东和广西等地[1].2021年版中国药典将流苏石斛收载为中药石斛的基原药材之一.流苏石斛生于树木之上，为木斛的代表品种[2].南北朝时期医家本草著作在论述中提及木斛不可用，但到明清时期，将木斛作为石斛使用的现象已非常普遍，说明流苏石斛作为中药石斛的基原药材有其历史渊源[2].

流苏石斛含有多种化学成分，包括多糖[3]、联苄类[4]、菲类[5]及甾体[6]等.其中，多糖具有增强机体免疫功能的作用[7].联苄类化合物moscatilin对HL-60 、SMMC-7721等多种癌细胞具有较强的抑制作用[8]，流苏菲对人胃癌细胞有一定的抑制作用[9].前人的研究表明流苏石斛化学成分的生物活性比较广泛.对其开展化学成分及生物活性的研究，有利于提高对中药石斛的全面认识和推广.本实验对流苏石斛乙醇提取物进行分离、纯化得到11个化合物(见图1).化合物5～11均为首次从该植物中分离得到，部分化合物显示了一定的体外抗炎和α-葡萄糖苷酶抑制活性.

1 实验与方法

1.1 仪器与材料

OSB-2100旋转蒸发仪(中国，上海爱郎博仪器有限公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪(美国，美国Agilent公司)；AL104电子分析天平(中国，梅特勒-托利多仪器有限公司)；多功能全波长酶标仪(中国，赛默飞世尔科技有限公司)；Bruker AV-400 核磁共振仪(瑞士，布鲁克公司)；200～300目硅胶(中国，青岛海洋化工厂)；Agilent XDB-C18色谱柱(9.4 mm×250 mm，5 μm，美国Agilent公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(20～150 μm，瑞典，Pharmacia精细化工有限公司)；RAW264.7巨噬细胞系(中国科学院昆明动物研究所)；NO检测试剂盒(中国，上海碧云天生物技术公司)；阿卡波糖(中国，北京百灵威科技有限公司)；脂多糖、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)(中国，sigma-aldrich(上海)贸易有限公司)；其余分析纯、色谱级试剂(中国，广东光华科技股份有限公司).

流苏石斛(DendrobiumfimbriatumHook.)由刘宏程研究员(云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所)鉴定和提供.现将标本编号为No.202009DF，并存入云南民族大学民族医药学院标本室.

图1 化合物1～11的化学结构

1.2 提取与分离

流苏石斛 1.35 kg，粉碎，用95%工业乙醇提取，减压浓缩得浸膏 80 g，加100目硅胶拌样，用石油醚∶乙酸乙酯(95∶5、90∶10、80∶0、70∶30、60∶40、0∶100,V/V)梯度洗脱，经硅胶柱层析分离，得到5个组分(Fr.1～Fr.5).Fr.1用sephadex LH-20分离，以石油醚∶氯仿∶甲醇(4∶4∶1,V/V)洗脱，再以100%甲醇纯化，得到化合物7(10.0 mg).Fr.2用sephadex LH-20分离，以石油醚∶氯仿∶甲醇(4∶4∶1,V/V)洗脱，得到化合物8(12.0 mg)，以氯仿∶甲醇重结晶，得到化合物9(67.1 mg)，以100%甲醇洗脱得到化合物10(16.0 mg)和化合物11(22.0 mg).Fr.3用sephadex LH-20分离，先以石油醚∶氯仿∶甲醇(4∶4∶1,V/V)洗脱，再用甲醇∶水(36∶64,V/V)为流动相经高效液相色谱分离，得到化合物6(5.1 mg).Fr.4用sephadex LH-20柱分离，以100%甲醇洗脱，得到化合物1(92.1 mg)、化合物2(5.1 mg)及Fr.4a组分.Fr.4a经sephadex LH-20柱用石油醚∶氯仿∶甲醇(4∶4∶1,V/V)洗脱，得到化合物3(12.3 mg).Fr.5以甲醇∶水(56∶44,V/V)为流动相经高效液相色谱分离，得到化合物4(6.4 mg)，以甲醇∶水(35∶65,V/V)为流动相经高效液相色谱分离，得到化合物5(6.4 mg).

1.3 抗炎活性筛选

参照文献[21]报道的方法，取对数期细胞，通过消化重悬及细胞计数，使细胞密度为 1×107个/L，并接种于96孔板，于 37 ℃、5% CO2条件下培养箱培养 24 h 后，空白组除外其余各组每孔加 50 μL LPS刺激，样品组加入不同终浓度为100.00、50.00、25.00、12.50和 6.25 μmol/L 的待测化合物 50 μL，阳性对照组给L-NMMA(用药剂量终浓度为20、10、5、2.5、1.25 μmol/L)每孔 50 μL，各组平行3次，于 37 ℃、5% CO2培养箱条件下培养 24 h，取上清液测定NO浓度.具体方法为取 70 μL 细胞培养液，加入GriessⅠ试剂 50 μL，再加入等量的GriessⅡ试剂，混匀，于波长 540 nm 处测定吸光度.比对标准管得出上清液中的NO含量(μmol/L).利用GraphPadPrism 5软件处理数据得到IC50.

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

采用pNPG法测定化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性，实验参照文献[22]报道的方法，并做调整.样品组(A1)以 10 μL 不同浓度的样品待测液分别加入96孔板中，并与 20 μL 的 0.2 U/mL 葡萄糖苷酶溶液混匀，37 ℃ 恒温反应 5 min 后，各管加入 20 μL 的 2.5 mmol/L PNPG底物，在 37 ℃ 下继续恒温反应 15 min，再加入 50 μL 的 0.4 mol/L 碳酸钠溶液终止反应，于 405 nm 波长处测定吸光度.以阿卡波糖为阳性对照，空白组(A0)以PBS代替酶液，阴性对照组(A2)以DMSO代替样品.样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率计算公式如下：

抑制率(%)=[A2-(A1-A0)]/A2×100

2 结构鉴定

化合物1白色粉末，C15H12O3，不饱和度为10，ESI-MS(m/z): 241[M+H]+.1H NMR(CD3OD,400 MHz)显示1个甲氧基质子信号δH4.03(3H,s,4-OCH3)，其余均为双键上的质子:δH7.55(1H,d,J=8.8 Hz,H-9),7.42(1H,s,H-10),7.40(1H,m,H-7),7.35(1H,dd,J=7.6,1.6 Hz,H-6),7.12(1H,dd,J=7.4,1.8 Hz,H-8),6.98(1H,d,J=2.4 Hz,H-1),6.90(1H,d,J=2.4 Hz,H-3).13C NMR(CD3OD,100 MHz)显示15个碳信号:δC157.7(C-4),156.7(C-2),154.9(C-5),137.6(C-10a),135.4(C-8a),129.9(C-7),127.5(C-9),127.2(C-10),121.6(C-8),120.0(C-4b),117.1(C-6),114.3(C-4a),108.2(C-1),103.1(C-3),包括1个甲氧基δC58.9(4-OCH3).综合分析以上数据，发现与文献[10]报道的数据基本一致，故鉴定该化合物为moscatin.

化合物2白色粉末，C15H16O3，不饱和度为8，EI-MS(m/z): 244[M]+.13C NMR(CD3OD,100 MHz)显示15个碳信号:δC162.2(C-5),159.4(C-3),158.3(C-3′),145.5(C-1),130.2(C-5′),120.8(C-6′),116.3(C-4′),114.7(C-1′),113.8(C-2′),109.1(C-6),106.6(C-2),100.0(C-4),55.5(5-OCH3),39.2(C-α),38.8(C-α′),和化合物1的数据相似.不同之处在于化合物2出现了2个亚甲基信号.化合物2比1少2个不饱和度，在1的已知结构基础上推测2可能为联苄类结构.1H NMR(CD3OD,400 MHz)显示1个甲氧基δH3.71(3H,s,5-OCH3)、2个亚甲基δH2.74-2.84(4H,m,H-α,α′)和一系列双键上的质子信号δH7.05(1H,dd,J=7.8,15.4 Hz,H-5′),6.66(1H,d,J=7.7 Hz,H-4′),6.63(1H,t,J=1.8 Hz,H-2′),6.60(1H,dd,J=8.0,2.4 Hz,H-6′),6.24(1H,d,J=1.9 Hz,H-2),6.23(1H,d,J=2.2 Hz,H-6),6.19(1H,t,J=2.2 Hz,H-4).综合以上数据，发现与文献[11]报道的数据基本一致，故鉴定该化合物为batatasin Ⅲ.

化合物3白色粉末，C16H18O4，不饱和度为8，ESI-MS(m/z):273[M-H]-.1H NMR(CD3OD,400 MHz)显示2个甲氧基δH3.79(3H,s,3′-OCH3),3.71(3H,s,5-OCH3)、2个亚甲基δH2.71-2.82(4H,m,H-α,α′)和多个双键上的质子信号δH6.70(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.67(1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),6.61(1H,dd,J=8.0,1.9 Hz,H-6′),6.24(2H,m,H-2,6),6.19(1H,t,J=2.2 Hz,H-4).13C NMR(CD3OD,100 MHz)显示16个碳信号:δC162.2(C-5),159.3(C-3),148.7(C-3′),145.6(C-4′),145.6(C-1),134.7(C-1′),121.9(C-6′),116.0(C-5′),113.4(C-2′),109.2(C-2),106.7(C-6),99.9(C-4),56.3(3-OCH3),55.5(3′-OCH3),39.5(C-α),38.4(C-α′)，和化合物2的数据非常相似，仅多了1个甲氧基取代.结合参考文献[12]的数据分析，鉴定该化合物为石斛酚.

化合物4无色固体，C17H20O5，不饱和度为8，ESI-MS(m/z): 305 [M+H]+.1H NMR(CD3OD,400 MHz)显示以下质子信号:δH6.71(1H,d,J=8.0 Hz,H-2′),6.67(1H,d,J=1.9 Hz,H-5′),6.61(1H,dd,J=8.0,1.9 Hz,H-6′),6.40(2H,s,H-2,6),3.79(6H,s,3-OCH3,5-OCH3),3.62(3H,s,3′-OCH3),2.80(4H,d,H-α,H-α′).13C NMR(CD3OD,100 MHz)显示17个碳信号:δC149.0(C-3,5),148.7(C-3′),145.6(C-4′),134.8(C-4),134.8(C-1′),134.0(C-1),122.1(C-6′),116.0(C-5′),113.6(C-2′),107.0(C-2,C-6),56.7(3-OCH3,5-OCH3),56.4(3′-OCH3),39.5(C-α),38.9(C-α′).以上数据表明化合物4比3多了1个甲氧基取代，结合参考文献[13]的数据分析，鉴定该化合物为moscatilin.

化合物5黄色粉末，C15H12O5，不饱和度为10，ESI-MS(m/z): 273[M+H]+.1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.31(2H,d,J=8.0 Hz,H-2′,6′),6.82(2H,d,J=8.0 Hz,H-3′,5′),5.88(1H,d,J=3.5 Hz,H-8),5.88(1H,d,J=3.5 Hz,H-6),5.32(1H,d,J=12.7 Hz,H-2),3.09(1H,dd,J=16.1,13.6 Hz,H-3a),2.66(1H,d,J=17.0 Hz,H-3b);13C NMR(CD3OD,400 MHz)δ:197.7(C-4),168.6(C-7),165.5(C-5),164.9(C-9),159.0(C-4′),131.1(C-1′),103.3(C-10),129.0(C-2′,6′),116.3(C-3′,5′),97.1(C-6),96.3(C-8),80.4(C-2),44.0(C-3).以上数据表明化合物5是二氢黄酮类结构，参照文献[14]的数据分析，鉴定该化合物为柚皮素.

化合物6黄色固体，C10H10O3，不饱和度为6，ESI-MS(m/z): 179[M+H]+.1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:9.61(1H,d,J=7.9 Hz,H-9),7.61(1H,d,J=15.7 Hz,H-7),7.28(1H,d,J=1.9 Hz,H-2),7.20(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6),6.88(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),6.67(1H,dd,J=15.7,7.9 Hz,H-8),3.93(3H,s,3-OCH3);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:196.2(C-9)，156.2(C-7),151.7(C-3),149.5(C-4),127.6(C-1),126.7(C-8),125.1(C-6),116.7(C-5),112.2(C-2),56.5(3-OCH3).结合参考文献[15]的数据分析，将化合物6鉴定为松柏醛.

化合物7白色粉末，C11H10O4，不饱和度为7，ESI-MS(m/z) 229[M+Na]+.1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.91(1H,dd,J=9.5,1.7 Hz,H-4),7.16(1H,d,J=2.4 Hz,H-5),7.00(1H,d,J=2.8 Hz,H-8),6.29(1H,dd,J=9.4,1.0 Hz,H-3),3.95(3H,s,6-OCH3),3.90(3H,s,7-OCH3);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:163.8(C-2),154.8(C-7),151.3(C-9),148.1(C-6),145.9(C-4),113.6(C-5),113.1(C-10),110.0(C-3),101.0(C-8),56.9(6-OCH3),56.9(7-OCH3).结合参考文献[16]的数据分析，表明化合物7是香豆素类结构，故鉴定该化合物为scoparone.

化合物8白色固体，C7H6O2，不饱和度为5，ESI-MS(m/z): 123[M+H]+.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:9.84(1H,s,-CHO),7.82(2H,d,J=8.6 Hz,H-2,H-6),7.00(2H,d,J=8.6 Hz,H-3,H-5);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:190.7(CHO),161.2(C-4),131.7(C-2),131.7(C-6),128.5(C-1),115.1(C-3),115.1(C-5).上述数据表明该化合物为对羟基苯甲醛[17].

化合物9白色粉末，C27H42O3，不饱和度为7，ESI-MS(m/z): 415[M+H]+.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.32(1H,d,J=3.2 Hz,H-6),4.40(1H,dd,J=7.4,14.9 Hz,H-16),3.44～3.50(1H,m,H-26β),3.34(1H,t,J=10.8 Hz,H-26α),1.00(3H,s,CH3-19),0.95(3H,d,J=6.9 Hz,CH3-21),0.76(3H,m,CH3-27),0.75(3H,m,CH3-18).13C NMR(CDCl3,100 MHz)显示27个碳信号:δC141.0(C-5),121.4(C-6),109.4(C-22),80.9(C-16),71.7(C-3),66.9(C-26),62.2(C-17),56.5(C-14),50.3(C-9),42.1(C-4),41.7(C-20),40.5(C-13),39.9(C-12),37.2(C-1),36.6(C-10),32.2(C-7),31.9(C-15),31.7(C-8),31.4(C-23),30.4(C-2),30.4(C-25),28.8(C-24),21.1(C-11),19.4(C-19),17.1(C-27),16.4(C-18),14.6(C-21).其中包括4个甲基和1个季碳(δC109.4)的特征信号，表明化合物9可能为螺甾烷类结构，结合参考文献[18]的数据分析，故鉴定为薯蓣皂素.

化合物10白色粉末，C29H48O2，不饱和度为6，ESI-MS(m/z): 429[M+H]+.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.69(1H,d,J=1.3 Hz,H-6),3.67(1H,m,H-3),1.20(3H,s,19-CH3),0.94(3H,d,J=6.5 Hz,21-CH3),0.84(3H,d,J=0.9 Hz,29-CH3),0.82(3H,d,J=1.5 Hz,26-CH3),0.80(3H,s,27-CH3),0.69(3H,J=6.3 Hz,18-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:202.3(C-7),165.1(C-5),126.2(C-6),70.6(C-3),54.8(C-17),50.2(C-14),50.2(C-9),45.5(C-8),45.5(C-24),43.4(C-13),42.1(C-4),38.9(C-12),38.5(C-10),36.2(C-1),36.1(C-20),34.1(C-22),31.5(C-2),29.2(C-16),29.2(C-25),26.6(C-15),26.3(C-23),23.1(C-28),21.2(C-11),19.8(C-26),19.1(C-27),19.0(C-21),17.3(C-19),12.0(C-18),12.0(C-29).上述数据与文献[19]比对基本一致，故该化合物被鉴定为7-酮基-β-谷甾醇.

化合物11白色粉末，C30H48O3，不饱和度为7，ESI-MS(m/z): 456 [M]+.1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ: 5.13(1H,t,J=3.3 Hz,H-12),3.00(1H,m,H-3α),2.10(1H,d,J=11.3 Hz,H-18),0.81(3H,d,J=6.4 Hz,Me),1.04,0.89,0.86,0.81,0.74,0.67(18H,s,Me);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:178.2(C-28),138.3(C-13),124.6(C-12),76.9(C-3),54.7(C-5),52.3(C-18),47.1(C-9),46.9(C-17),41.7(C-14),38.6(C-19),38.5(C-20),38.3(C-8),38.3(C-4),38.2(C-l),36.5(C-10),36.2(C-22),32.6(C-7),30.1(C-21),28.3(C-23),27.4(C-15),27.1(C-2),23.8(C-16),23.2(C-27),22.9(C-11),21.0(C-30),18.0(C-6),17.1(C-29),16.8(C-26),16.0(C-25),15.1(C-24).上述数据与文献[20]比对基本一致，故该化合物被鉴定为熊果酸.

抗炎活性筛选实验结果与阳性对照L-NMMA IC50=(13.15±2.24) μmol/L比较，化合物1、2、3、7对NO生成具有一定的抑制作用，其IC50值分别为(67.50±4.73)、(65.86±5.31)、(39.82±3.48、81)和(41±5.67)μmol/L.

α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选实验结果显示，与阿卡波糖IC50=(298.45±6.92)μmol/L比较，化合物2、3、5、9具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50分别为(288.81±5.98)、(363.21±7.82)、(118.24±6.37)和(377.42±9.35)μmol/L.

3 结语

从流苏石斛乙醇提取物中共分离得到11个化合物，结构类型涉及菲类、联苄类、甾体类、三萜类等，化合物5～11均为首次从该植物中分离得到.所有化合物中属化合物1和9的含量最高，应为主要化学成分。流苏石斛中具有抗炎和α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物主要集中在化合物1～3(联苄类结构)，说明联苄类化合物可能是其主要的活性成分，以期该研究结果为流苏石斛活性成分的进一步发现和研究提供部分借鉴.