补肾活血方对复发性流产小鼠母胎界面血管微环境的影响

夏垒，韩雪，董莉，夏艳秋

1.上海中医药大学，上海 201203；2.西安市中医医院，陕西 西安 710016；3.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是常见的妊娠并发症，发生率为1%～5%，目前仍有超过半数的RSA病因尚不明确。无论何种病因，母胎界面局部微环境在妊娠建立和维持中都起到重要作用。母胎界面中胎盘微血管的生成及胎盘血管网络的构建对妊娠维持至关重要。有学者认为，RSA的发生与妊娠期母体子宫螺旋动脉和胚胎绒毛血管中形成微小血栓有关，其可能导致子宫-胎盘循环血液灌注不良，增加妊娠丢失的风险。

补肾活血方是国医大师朱南孙教授临床治疗RSA的经验方，前期研究显示，该方有助于改善患者卵巢血流动力情况，调节炎症因子平衡。本研究在前期研究基础上观察该方对RSA小鼠母胎界面血管生成及微小血栓的影响，进一步探讨其作用机制，以期为临床应用和后续研究提供参考。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雌性CBA/J小鼠40只、雄性DBA/2J小鼠15 只、雄性BALB/c 小鼠5 只，6～7 周龄，体质量（20±2）g，上海吉辉实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（沪）2017-0012。常规饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心SPF级动物房，温度25～27 ℃，湿度40%～50%，12 h光照/黑暗循环，自由摄食饮水。

1.2 药物

补肾活血方（黄芪20 g，党参20 g，丹参20 g，当归20 g，巴戟天15 g，淫羊藿15 g，菟丝子12 g，熟地黄12 g，覆盆子12 g），由上海中医药大学中药制剂中心制成汤剂，每1 mL含原药材1.46 g，置于4 ℃冰箱冷藏备用。地屈孕酮片，荷兰Abbott Biologicals B.V.，10 mg/片，批号360591，药片碾碎后用蒸馏水溶解，制成浓度为1 mg/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

HE染色试剂盒、Trizol、一氧化氮（NO）检测试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为C0105M、R0016、S0021S、P0013、P0009；RT-PCR 试剂盒，日本TaKaRa公司，批号RR047A；血管内皮生长因子（VEGF）抗体、血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）抗体、GAPDH 抗体、HRP 标记羊抗鼠IgG、HRP 标记羊抗兔IgG，美国Proteintech 公司，批号分别为 19003-1-AP、66804-1-lg、60004-1-lg、SA00001-1、SA00001-2；ECL发光液，美国Millipore公司，批号WBKLS0100；血栓素B2（TXB2）试剂盒、6-酮前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号分别为H173、H204-1。HM325石蜡切片机（美国Thermo 公司），EG1150 自动包埋机（德国Leica 公司），Axio Scope.A1 光学显微镜（德国Carl Zeiss公司），SCIENTZ-48高通量组织研磨器（中国宁波新芝生物科技股份有限公司），Centrifuge 5427R低温高速离心机（德国Eppendorf公司），QuantStudio3实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），VORTEX-6涡旋振荡仪（上海其林贝尔），Synergy2多功能酶标仪（美国Bio-Rad公司），PowerPAC3000垂直电泳仪（美国Bio-Rad 公司），FluorChem R 化学发光成像系统（美国Protein Simple公司）。

2 实验方法

2.1 造模、分组及给药

小鼠适应性喂养1周后，将CBA/J雌鼠与DBA/2J雄鼠2∶1合笼饲养建立RSA模型，同时将CBA/J雌鼠与BALB/c雄鼠2∶1合笼饲养建立正常妊娠作为正常组，次日检查雌鼠阴道，见阴栓者表明造模成功，若未见阴栓，则继续合笼饲养。将成模小鼠随机分为模型组、中药组和西药组，每组10只。镜下见精子或阴道口见阴栓当天记为妊娠第1日，各组于妊娠第1日开始灌胃，根据小鼠与成人体表面积换算等效剂量，中药组灌胃补肾活血方（30 g/kg），西药组灌胃地屈孕酮溶液（6.15 mg/kg），灌胃体积0.3 mL/只，正常组和模型组予等体积蒸馏水灌胃，连续13 d。

2.2 标本采集

小鼠末次灌胃24 h 后腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，摘眼球取血，剖视子宫观察胚胎情况并拍照；分离蜕膜组织，液氮速冻后置-80 ℃冰箱中保存。

2.3 胚胎丢失率计算

统计胚胎总数、流产胚胎数，计算胚胎丢失率。胚胎丢失率（%）＝流产胚胎数÷总胚胎数×100%。

2.4 HE染色

将蜕膜组织置于4%多聚甲醛中固定24 h，常规脱水，透明，包埋，切片（厚度6 μm），脱蜡，脱水，苏木精染色8 min，流水冲洗，伊红染色1 min，流水冲洗，脱水，透明，中性树胶封片后，置于光镜下观察蜕膜组织病理形态。

2.5 RT-PCR检测

取蜕膜组织，加入Trizol提取总RNA，微量分光光度计测定RNA 纯度及浓度。将总RNA 反转录为cDNA，扩增程序为两步法：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共40个循环。以18S为内参，2法计算mRNA 相对表达量。透明质酸合成酶（HAS）引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.6 Western blot检测

取蜕膜组织，加入RIPA裂解液，匀浆研磨机研磨，4 ℃、14 000 r/min离心20 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。等量蛋白上样，10%凝胶电泳，将蛋白电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，滴加VEGF一抗（1∶1 000）、VE-cadherin一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶5 000），4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加入相应二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL发光液曝光，化学发光成像系统成像，以GAPDH为内参，采用AlphaView SA软件对蛋白条带灰度值进行分析。

2.7 硝酸还原酶法检测

取蜕膜组织，加入裂解液，匀浆研磨机研磨，4 ℃、14 000 r/min离心20 min，取上清液，按50µL/孔向96 孔板中加入标准品或样品，再分别加入Griess ReagentⅠ和Griess ReagentⅡ，酶标仪波长540 nm处检测各孔OD值，根据标准曲线计算样品中NO含量。

2.8 ELISA检测

将血液于室温静置10 min，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，吸取上层血清，按照ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪波长450 nm处检测各孔OD值，根据标准曲线计算血清TXB2和6-Keto-PGF1α含量。

3 统计学方法

4 结果

4.1 补肾活血方对模型小鼠胚胎丢失率的影响

正常组小鼠胚胎粗大如串珠状，胚胎发育均匀，颜色淡红，宫腔内无出血点及明显瘀血；模型组小鼠胚胎呈竹节样改变，胚胎发育不匀称或体积缩小甚至无胚胎，颜色黯红或黑褐，宫腔内可见明显出血点或瘀血；中药组和西药组小鼠胚胎形态明显改善，胚胎发育较均匀。见图1。

图1 各组小鼠胚胎形态

与正常组比较，模型组小鼠胚胎丢失率显著升高（＜0.001）；与模型组比较，中药组和西药组小鼠胚胎丢失率显著降低（＜0.01，＜0.05）；中药组与西药组差异无统计学意义（＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠胚胎丢失率比较（）

4.2 补肾活血方对模型小鼠蜕膜组织病理形态的影响

正常组小鼠蜕膜细胞呈卵圆形，排列整齐，胞质丰富，核仁明显，血管丰富，管壁完整；模型组小鼠蜕膜细胞碎裂，数量减少，胞浆水肿、空泡样变，部分细胞核消失，血管数量减少；中药组小鼠少数蜕膜细胞胞浆水肿、空泡样变，血管内皮细胞较为完整，生长良好；西药组小鼠部分蜕膜细胞胞浆水肿、空泡样变，血管内皮细胞不完整。见图2。

图2 各组小鼠蜕膜组织形态（HE染色，×200）

正常组小鼠迷路滋养层细胞呈网状排列，细胞核清晰，胞质丰富，母血窦丰富，组织结构清晰；模型组小鼠迷路滋养层细胞增生肥大，细胞核和胞质界限模糊，胞浆广泛空泡化，部分细胞变性、坏死、结构不清晰；中药组小鼠迷路滋养层细胞呈网状排列，细胞核清晰，胞质丰富，母血窦较为丰富，整体结构完整；西药组小鼠迷路滋养层细胞呈网状排列，部分细胞核染色加深，形态不规则，胞浆呈空泡样改变，部分区域结构不清晰。见图3。

图3 各组小鼠迷路组织形态（HE染色，×200）

4.3 补肾活血方对模型小鼠蜕膜组织透明质酸合成酶mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠蜕膜组织HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA 表达均显著降低（＜0.05，＜0.001，＜0.01）；与模型组比较，中药组和西药组小鼠蜕膜组织HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA表达均显著升高（＜0.05，＜0.01，＜0.001）。见表3。

表3 各组小鼠蜕膜组织HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA表达比较（）

4.4 补肾活血方对模型小鼠蜕膜组织血管内皮生长因子、血管内皮钙黏蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠蜕膜组织VEGF、VE-cadherin表达显著降低（＜0.05，＜0.01）；与模型组比较，中药组和西药组小鼠蜕膜组织VEGF、VE-cadherin表达显著升高（＜0.01，＜0.001），且西药组显著高于中药组（＜0.05，＜0.01）。见图4。

图4 各组小鼠蜕膜组织VEGF、VE-cadherin蛋白表达比较（，每组10只）

4.5 补肾活血方对模型小鼠蜕膜组织一氧化氮含量的影响

与正常组比较，模型组小鼠蜕膜组织NO含量显著减少（＜0.01）；与模型组比较，中药组和西药组小鼠蜕膜组织NO含量显著增加（＜0.01，＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠蜕膜组织NO含量比较（，mol/L）

4.6 补肾活血方对模型小鼠血清血栓素B2、6-酮前列腺素F1α含量的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清6-Keto-PGF1α含量显著减少（＜0.001）；与模型组比较，中药组和西药组小鼠血清6-Keto-PGF1α 含量显著增加（＜0.001）。各组小鼠血清TXB2含量差异无统计学意义（＞0.05）。见表5。

表5 各组小鼠血清TXB2、6-Keto-PGF1α含量比较（，ng/L）

5 讨论

RSA属中医学“滑胎”范畴，该病具有连续性、自然性和应期而下的特点。朱氏妇科认为，本病病机多为肾虚与血瘀共存，肾虚为本，血瘀为标，治以补肾固胎、活血化瘀为主。据此，朱氏妇科第三代传承人国医大师朱南孙教授秉朱氏妇科“究奇经，养气血，毓麟之本”学术思想，创立补肾活血方，方中以巴戟天、淫羊藿为君药补肾填精；黄芪、党参、当归、丹参为臣药补气活血；熟地黄为佐药滋养肾精；菟丝子、覆盆子为使药平补肝肾。诸药共奏补肾活血、祛瘀安胎之功。

正常妊娠的维持有赖于母胎界面及胎盘植入部位的丰富血供，胎盘血管网络充分发育使母胎间营养物质等交换顺利进行，胚胎得以生长发育。透明质酸（HA）是一种位于血管内皮细胞外的大分子多糖，可直接影响血管生成，通常表达于绒毛细胞外基质和血管壁，能够维持胎盘形态及子宫胎盘血液循环。正常早孕阶段胎盘组织HA含量明显高于RSA组，高浓度和完整状态的HA在维持正常妊娠中具有重要作用。HAS是一类高效的双功能糖基转移酶，催化尿苷-5'-二磷酸-葡糖醛酸和尿苷-5'-二磷酸-乙酰氨基葡萄糖聚合为HA长链，可控制细胞迁移，修复磷状上皮细胞，在排卵期、胚胎形成及机体发育过程中均有所表达，可在一定程度上起到补偿组织细胞、维持器官功能的作用。HA的正常聚合可以增加胎盘中VEGF表达，从而在胚胎发育过程中调控母胎界面血管生成。研究发现，小鼠VEGF基因缺失会导致胚胎血管发育缺陷而致胚胎死亡，VEGF过表达会使母胎界面血管腔异常增大，导致胚胎数量减少和胚胎丢失率增加。NO作为VEGF的效应因子和诱导因子，在构建母胎界面血管生成渠道中担任重要角色，适量NO的产生是胎盘血管调节机制完善的体现。NO含量减少与HA降解直接相关，NO缺乏导致妊娠小鼠子宫动脉直径缩小，子宫血流量减少。VE-cadherin是钙黏素家族的重要成员，主要功能是维持血管内皮细胞相互连接、血管完整性和血管新生，缺乏VE-cadherin会影响VEGF介导的内皮细胞存活和血管生成，导致胚胎死亡。本实验中VE-cadherin蛋白在模型组小鼠蜕膜组织中低表达，中药组和西药组表达升高，且西药组异常高表达，这可能与西药组高表达VEGF有关。研究表明，VEGF可以上调VE-cadherin表达及磷酸化，但VE-cadherin过表达容易引起细胞间黏附加强，具有抑制滋养层细胞迁移、浸润作用，滋养层细胞浸润不足会造成自然流产。因此，西药组VE-cadherin高表达可能不利于新生血管生成。而补肾活血方对于新生血管内皮细胞间的连接具有保护作用，能维持血管内皮屏障功能。TXB2、6-Keto-PGF1α互为拮抗作用，在管壁紧张度、血小板激活和血流机制中起相反调节作用，6-Keto-PGF1α/TXB2 比例降低会导致血栓风险增加。本实验中除模型组小鼠血清6-Keto-PGF1α 含量显著减少外，正常组、中药组和西药组小鼠血清TXB2、6-Keto-PGF1α含量无明星差异，提示中药和西药可增加小鼠外周血6-Keto-PGF1α含量以降低血栓风险。

综上所述，补肾活血方可显著降低RSA小鼠胚胎丢失率，增加血清6-Keto-PGF1α含量及蜕膜组织NO含量，上调VEGF、VE-cadherin、HAS 表达，改善RSA导致的血管生成障碍及血栓形成，实现母胎界面血管重塑，调节母胎界面血管微环境，减少不良妊娠结局。