替莫唑胺对胶质母细胞瘤基因表达谱影响的研究*

魏志豪 刘洪超 史康克 张 雨 李佳琼

河南科技大学教学医院 洛阳新区人民医院病理科，河南省洛阳市 471023

胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是人类最常见的原发性恶性脑肿瘤，以肿瘤细胞呈浸润性生长为主要特征，进展迅速。近年来虽然手术、放化疗技术得到了长足发展，但GBM患者的预后仍没有明显改善，其5年生存率不足10%[1]。替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)是目前治疗GBM的一线化疗药物。TMZ是一种新型口服烷化剂类抗肿瘤药物，其优点是具有较宽的抗肿瘤谱、易于透过血脑屏障、与其他药物没有叠加毒性等。目前认为DNA甲基化和错配修复失败是TMZ细胞毒性的主要机制[2]。然而临床研究表明TMZ对GBM的治疗有效率却只有45%左右，脑胶质瘤对TMZ产生耐药性是导致化疗失败的最主要原因[3-4]。本研究从基因表达公共数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)中下载TMZ处理裸鼠颅内移植瘤的芯片数据并进行生物信息学分析，探索TMZ对胶质母细胞瘤基因表达谱的影响，为深入研究TMZ细胞毒性机制和耐药机制提供参考依据，为胶质瘤的治疗提供有效的新方案。

1 材料与方法

1.1 材料 数据来源：从GEO数据库中下载表达谱数据集GSE47809，该数据集共包含7个样品，其中4个为TMZ处理组脑肿瘤组织，其余3个是未处理组脑肿瘤组织。

实验方案：先采用干细胞培养液(神经培养基中加入B27添加物、30ng/ml表皮生长因子和30ng/ml碱性成纤维细胞生长因子)培养胶质母细胞瘤神经球(Glio6)，然后利用立体定向注射法将体外培养的神经球(含5×105细胞)注入雌性裸鼠右侧尾状核，构建裸鼠颅内移植瘤模型。细胞移植后45d，其中4只裸鼠灌胃给予TMZ，其余3只裸鼠灌胃给予等体积溶媒，连续5d。细胞移植后75d，切除脑部肿瘤组织，采用MirVana分离试剂盒提取总RNA，进行基因转录谱检测。芯片检测平台为GPL570平台，即Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2 差异表达基因筛选 将GSE47809数据文件导入GEO2R在线工具，定义实验组和对照组。GEO2R首先采用GEOquery R软件包将GEO数据解析成R数据结构，然后运用limma软件包统计每个基因的统计学显著水平[5]。差异表达基因(Differentially expressed genes，DEGs)的筛选条件为：P<0.05，组别差异倍数≥2倍。

1.3 基因本体富集分析 基因本体(Gene Ontology，GO)是国际标准化的基因功能分类系统，对基因和蛋白质的功能进行限定和描述。本研究把筛选出的差异基因向GO数据库映射，计算出每个条目对应的基因数目，利用Fisher精确检验统计富集水平，并采用Benjamini-Hochberg方法控制错误发现率(False discovery rate，FDR)，显著富集GO条目的标准为P<0.05，FDR<0.05。

1.4 通路富集分析 本研究基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)数据库，采用Fisher检验统计DEGs在各个通路中的富集程度，以P<0.05为阈值筛选与整个基因组背景相比，在差异基因中显著性富集的信号通路。

1.5 互作网络构建 对输入的差异表达谱数据，计算出各基因间的相关系数矩阵，借鉴数据所具有的无标度性质，通过基因间的相关系数拟合基因的无标度网络关系。另外以通路为单位，运用图论的方法将显著性通路基于KEGG数据库中的相互作用关系构建通路互作网络，分析显著富集通路之间的传导关系[6]。

2 结果

2.1 差异基因筛选结果 以未给予TMZ处理的颅内移植瘤组织作为对照组，给予TMZ处理的移植瘤组织作为实验组，根据筛选条件P<0.05，差异倍数≥2倍，共筛选出1 936个DGEs，其中上调基因1 031个，下调基因905个，部分差异基因如表1所示。

表1 部分差异表达基因列表

2.2 GO功能富集分析 对差异基因进行GO功能注释后发现，显著富集的分子功能主要集中于蛋白结合、ATP结合、转录因子活性、细胞骨架结合、蛋白激酶活性、DNA结合、金属离子结合等；显著富集的生物学过程主要包括信号转导、转录调控、轴突导向、细胞凋亡调控、细胞黏附、细胞周期停滞和DNA复制等，富集水平最显著的前20个条目列于表2。

表2 差异基因基因本体富集分析

2.3 通路富集分析 将差异基因向KEGG数据库映射，结果发现肿瘤通路、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)-Akt信号通路、细胞骨架调节、细胞周期、Hippo信号通路、P53通路等79个通路显著富集，富集水平最显著的前20个列于表3。

2.4 互作网络分析结果 基于KEGG数据库中信号通路的上下游关系，构建显著富集通路之间的相互作用关系网络图如图1所示，圆点大小代表degree值，圆点越大，在网络中的作用越重要。由通路互作网络图可知，核心通路包括MAPK信号通路(degree=27)、细胞凋亡(degree=21)、肿瘤通路(degree=19)和细胞周期(degree=18)。另外基因共表达网络筛选出的核心基因包括PI3KCD、AKT3、表皮生长因子受体(EGFR)、蛋白磷酸酶1催化亚基β(PPP1CB)、磷脂酰肌醇5-激酶1α(PIP5K1A)、辅肌动蛋白α1(ACTN1)。

3 讨论

TMZ细胞毒性被认为是对DNA的甲基化，甲基化主要发生在鸟嘌呤的N7和O6位置上。DNA复制过程中，错配修复系统虽能识别错误配对的碱基对，但不能为O6-甲基鸟嘌呤找到配对碱基，导致子链DNA缺口形成。缺口随细胞分裂而逐渐积累，最终阻碍复制启动，从而使细胞停滞在G2/M期进而发生凋亡。O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)能与鸟嘌呤6位氧上的烷基化合物结合，将烷基转移到MGMT第145号半胱胺酸活性位上，使烷基化的鸟嘌呤被还原，错配修复途径的蛋白复合物因缺陷而导致不能识别错配，从而使细胞容忍甲基化存在，避免子链DNA缺口出现，导致TMZ耐药性[7]。越来越多的研究发现，脑胶质瘤产生TMZ耐药性不是由单一因素影响导致的，主要包括DNA损伤修复，促癌基因表达，化疗药物刺激后机体应激反应等方面[8-9]。

表3 差异基因通路富集分析

图1 通路相互作用网络分析

本研究对TMZ处理组和未处理组脑肿瘤组织的表达谱进行分析，共筛选出1 936个差异基因，富集分析表明这些差异基因主要涉及转录调控、信号转导、细胞凋亡调控、细胞黏附、细胞周期停滞和DNA复制等生物过程，参与MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞骨架调节、细胞周期、P53信号通路等。TMZ处理后GBM组织中PIK3CD、AKT3等基因表达下调，EGFR、PPP1CB、ACTN1等基因表达上调，引起代谢通路和信号通路变化，阻滞DNA复制和细胞周期进程并诱导其凋亡。网络分析挖掘出的核心基因和关键通路可能是TMZ抑制GBM的潜在靶点，具体分子机制有待进一步研究。

总之，替莫唑胺引起胶质母细胞瘤基因转录谱发生明显改变，主要涉及细胞周期阻滞、凋亡诱导、MAPK信号通路、细胞侵袭和转移等生物过程和信号通路，为深入研究TMZ细胞毒性机制和耐药机制提供了参考，也为指导临床个体化应用以及开发新型靶向治疗提供基础。