母猪免疫PCV-2疫苗对仔猪感染PCV-3的影响

张 黎，郑龙龙，吕晓玲，白 瑞，霍乃蕊，郑明学 (山西农业大学 动物医学学院，山西 太谷 030801)

猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3，PCV-3)可引起一种免疫抑制疾病，常表现出皮炎肾病综合征、繁殖功能障碍、呼吸系统疾病和多系统炎症等相关的疫病，对我国部分感染猪场的疫病防控造成巨大的困难[1-2]。2015年我国研究者通过PCV-3核酸检测发现部分种猪群中存在30%的PCV-3核酸阳性，常引起母猪流产、仔猪腹泻和呼吸系统症状为主的临床症状，在临床生产中对仔猪的危害性最大，且随着种猪及仔猪的调运，流行范围呈不断扩大的趋势[3-4]。

安全高效的疫苗是防控一切病毒性疾病的首选，但目前尚无PCV-3商品化疫苗可用。降低母猪带毒量，减少病毒垂直传播给仔猪的载量，可能是当前最简便的防控方式。PCV ORF2基因编码病毒的衣壳蛋白(capsid protein,Cap)作为PCV唯一的结构蛋白和主要的免疫保护性抗原，以其为靶抗原研制的PCV-2基因工程疫苗备受青睐[5]。湛洋等[6]通过对PCV-2与PCV-3 Cap结构和抗原性的生物信息学分析发现二者具有较大的差异，推测不存在交叉免疫保护能力。

本研究通过对比山西省某商品母猪场免疫PCV-2疫苗29个月内的ORF2基因阳性率、猪群临床症状、育肥期生产成绩，并对PCV-3-CN-SX1-2019(NMDC序列号：NMDCN0000NPN)、PCV-3-CN-SX2-2019(NMDC序列号：NMDCN0000NPO)、PCV-3-CN-SX1-20209(NMDC序列号：NMDC-N0000NPP)、PCV-3-CN-SX2-2020(NMDC序列号：NMDCN0000NPQ)、PCV-3-CN-SX1-2021(NMDC序列号：NMDCN0000NPR)、PCV-3-CN-SX2-2021(NMDC序列号：NMDCN0000NPS)进行部分分子生物学分析，了解其与我国部分其他省份的PCV同源性，为深入研究我国PCV-3的遗传变异及其生物学特性以及评估母猪免疫PCV-2疫苗对仔猪PCV-3病毒学和病理学方面的交叉保护作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源2018年10月到2021年5月连续从山西省某500头种猪未免疫过PCV-2疫苗的商品母猪场连续采购6批次12～17 kg保育猪，每批次1 000头左右。回场1周内(10～11周龄)均出现不同程度的腹式呼吸、黏稠黄白色鼻涕、耳尖及臀部充血发绀、皮肤出现红色丘疹、皮毛粗乱、猪群扎堆等症状，用药效果不显著，伤亡率达25.5%；经实验室ORF-2基因和细胞病理学诊断确诊为PCV-2、PCV-3及PRRSV共同感染。种猪群免疫PCV-2疫苗及使用药物控制方案后，所产仔猪全期伤亡率从25.5%逐渐降低到8.0%；采集6批次60～70日龄15～20 kg病死猪组织样品120份(每批次20份)，并对样品进行100℃煮沸处理后于-20℃冷冻保存，对PCV-3 ORF2基因进行核酸检测与基因测序，了解仔猪群PCV-3感染情况及ORF2基因进化规律。

1.2 试验材料QI Aamp DNA MiniKit(QIAN-GE)，EasyTap聚合酶(TaKaRa)，DL1000 DNA Marker(Biomed)，其他化学试剂均从Sigma-Aldrich公司购买。

1.3 样品处理取100 mg冰冻的淋巴结进行充分研磨，加入1 mL PBS液反复冻融3次，10 000 r/min离心5 min，取上清液0.2 mL提取DNA。

1.4 基因扩增参考WEN等[7]报道的方法对发病猪组织中的PCV-3 ORF2基因进行检测(F:5′-ATTATGGATGCTCCTCATCGTG-3′，R:5′-CA-TCTTCTCCGCAACTTCAGTC-3′)。反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸7 min。

1.5 基因序列测定与分析将鉴定为阳性的PCR产物进行测序分析，利用NCBI BLAST、DNAStar和Mega 5.0等生物学软件，分别对PCV-3 ORF2基因序列进行比对和遗传进化分析，并与国内外部分已知的参考序列进行比较并绘制遗传进化树，参考序列见表1。

表1 PCV-3毒株参考序列及其来源

1.6 磷酸化分析使用NetPhos 3.1 Server进行氨基酸磷酸化预测，为制备抗原、磷酸化抗体及基因突变研究提供理论依据。

1.7 信号肽预测使用SignalP-5.0 Server对Cap蛋白氨基酸N端进行信号肽预测，预测其促进蛋白分泌到胞外的能力。

1.8 跨膜结构预测使用TMHMM Server v.2.0进行跨膜结构预测，根据胞外区(outside)、胞内区(inside)、跨膜区(transmembrane)的数值预测在原核表达系统中表达的潜力，数值越大表示该氨基酸位于该区的可能性越大。

2 结果

2.1 同源性分析测序结果显示，共获得6株长度为252 bp PCV-3 ORF2基因。利用生物学软件DNAStar对基因序列与23条PCV序列进行核苷酸同源性分析，结果表明，此次从死亡仔猪淋巴结内分离出的PCV-3-CN-SX1-2019、PCV-3-CN-SX2-2019、PCV-3-CN-SX1-2020、PCV-3-CN-S1-2020、PCV-3-CN-SX1-2021及PCV-3-CN-SX2-2021毒株同源性为98.4%～99.2%；6株序列与PCV-2a(32.5%～32.9%)、HBxz-PCV2a(32.5%～32.9%)、XJ0904-PCV2a (32.5%～32.9%)同源性32.5%～32.9%；与GXHP-PCV-2b(31.2%～31.7%)、BJ0401-PCV2b(31.2%～31.7%)、SXTY-PCV-2b(30.8%～31.2%)同源性30.8%～31.7%；与XJ16-MD05-PCV2d(33.1%～33.5%)、CBNU0324-PCV-2d(32.6%～33.1%)同源性32.6%～33.5%；与HNU-AHZ-2019-PCV-4同源性33.9%～34.3%。6株序列ORF2基因与PCV-3 ORF2基因同源性为97.2%～99.6%，属于PCV-3基因型(图1)。

图1 PCV-3 ORF2基因同源性分析

6株PCV-3 ORF2基因与PCV-2a、PCV-2d、PCV-3、PCV-4进行基因进化树分型，结果显示与PCV-3基因型2012—2015年分离的浙江株ZJ-HB347-20120914、ZJ-459-20130424、ZJ-592-201408-01、ZJ-526-20150703，湖南2018年分离的PCV3-YiY-1-11、PCV3-YiY-2-11及新疆2018年分离的CN-Xinjiang-AL15-2018进化同步。与其他地域PCV-3基因型分离株PCV3-CH-Beijing-1-2016、PCV3-CN-HeNan17、YM2018-YN、CN-Xinjiang-AL15-2018、PCV3-CN-HLJ-p6-2018、FJ65、PCV3-CN-JL-JL44-2019，PCV-2a、PCV-2d、PCV-4进化不同步(图2)。

图2 PCV-3 ORF2基因遗传进化分析

2.2 氨基酸残基磷酸化预测结果显示，获得的6株PCV-3 ORF2基因均有17个磷酸化位点，其中11个蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)位点，3个Ⅰ型酪蛋白激酶(casein kinase Ⅰ,CKI)位点，3个没有特异性激酶预测结果位点(unsp kinase,UNSP)(表2，图3)。

表2 Cap蛋白氨基酸残基磷酸化预测

图3 PCV-3 Cap蛋白氨基酸残基磷酸化预测

2.3 信号肽预测6株PCV-3 ORF2基因编码的Cap蛋白氨基酸均未预测到信号肽的潜在可能性，蛋白 N 末端不存在典型的信号肽结构。

2.4 跨膜结构预测6株PCV-3 ORF2基因编码的Cap蛋白氨基酸位于胞外区的可能性最大，均未预测到跨膜结构存在的潜在可能性(图4)，蛋白可在原核表达系统中表达。

表3 Cap蛋白信号肽预测

图4 PCV-3 Cap蛋白跨膜结构预测

3 讨论

2018年10月到2021年5月连续从未免疫过PCV-2疫苗的商品母猪场采购6批次10周龄保育猪，全期伤亡率(8.0%～25.5%)。本研究从病死仔猪淋巴组织中获得6株PCV-3 ORF2基因，其与PCV-3基因型2012-2015年分离的浙江株、2018年湖南及新疆分离株进化同步；与1999-2020年分离的北京、河南、云南、黑龙江、福建、吉林等地区PCV-3、PCV-2a、PCV-2d、PCV-4基因型毒株进化不同步；磷酸化位点、信号肽、跨膜结构等预测结果一致，氨基酸进化同步。

健康猪群免疫高效商品疫苗是目前兽医临床上防控PCV-2的最主要手段，通过使用疫苗已经基本控制住疫情的大流行[8-12]。检测数据显示，我国部分地区PCV-3感染率呈逐年增加的趋势，但是目前鲜有报道PCV-3有安全有效的商品疫苗[13-15]。该病的防控面临着极大的困难，需要对其进行流行病学的持续调查和疫苗防控手段以外措施的不断探讨。

我国各地猪场在2018年后减少了疫苗的使用，部分猪场PCV-2疫苗长期不免疫或降低免疫频次用于减少非洲猪瘟传入的风险，造成地域性或个别场区种猪群PCV常年带毒生产，临床中时有断奶仔猪出现皮炎肾炎综合征的典型症状，给猪群造成免疫抑制性危害，同时也加大了PCV-3、PCV-4传入的风险和临床损失[16-18]。根据本研究数据显示，母猪免疫PCV-2疫苗能够给仔猪提供部分病毒学和病理学方面的保护，减少PCV-3核酸的检出率和伤亡率。