选择性酪氨酸激酶2抑制剂的研究进展

王力勋，朱佩钰，周金培，张惠斌

（1.中国药科大学新药研究中心，江苏 南京 210009；2.中国药科大学药物化学教研室，江苏 南京 210009）

细胞因子是调节机体自身免疫的关键因子，例如白细胞介素（interleukin，IL）、干扰素（interferon，IFN）等细胞因子都通过Janus激酶（Janus kinase，JAK）信号转导和转录激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）途径传递信号[1]。当细胞因子异常表达或细胞内通路失调时，免疫稳态被破坏，引起慢性炎症、自身免疫性疾病以及肿瘤的发生。抑制JAK可以阻断JAK-STAT通路，使介导人类疾病的相关传递受阻，从而阻断疾病的发生与发展[2]。这一策略成为治疗类风湿关节炎、银屑病和炎症性肠病（如克罗恩病、溃疡性结肠炎）等自身免疫性疾病的选择[3-4]。JAK家族共有4位成员，包括JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶2（tyrosine kinase，TYK2）。其中，TYK2参与IL-12、IL-23和Ⅰ型IFN的信号传导，且IL-12和IL-23的异常表达会引起银屑病和炎症性肠病等自身免疫性疾病[5-7]。研究发现，选择性抑制TYK2能够在临床治疗中避免广泛的免疫抑制[8]，已成为治疗自身免疫性疾病的潜在策略[9-10]。本文通过对TYK2的生物学结构、通路作用机制及其抑制剂的研究进展进行综述，以期为代谢性疾病药物的发展研究提供参考。

1 酪氨酸激酶2的生物学功能

1.1 Janus激酶家族及其功能

JAK家族成员，包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，是细胞因子受体相关的非受体酪氨酸蛋白激酶，其在结构上具有高度同源性，由7个不同结构域组成，从C端到N端分别为JH1 ～ JH7。根据JAK家族结构域的功能差异，7个不同结构域可分成4个不同功能域：1）激酶结构域（JH1），是腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）活性位点所在结构域，负责底物磷酸化；2）假激酶结构域（JH2），与JH1结构相似，但缺乏催化功能，参与调控JH1催化活性；3）Src同源2结构域（Src homology domain2，SH2）（JH3与JH4），用以稳定 JAK构 象；4）FERM（band-four-point-one ezrin radixin moesin）同源结构域[11]（见图1）。

图 1 JAK家族结构域Figure 1 Domain of Janus kinases

JAK家族蛋白在哺乳动物生命活动中起着重要作用。其中，JAK1缺失导致小鼠淋巴细胞增殖严重受损；JAK2能诱导并调节红细胞生成，当JAK2缺失时导致血小板减少，其过表达则与骨髓增生性疾病相关，如真红细胞增多症和原发性血小板增多症[12]；JAK3主要在淋巴组织和造血组织中表达，JAK3缺失的小鼠表现出严重的联合免疫缺陷症状（severe combined immunodeficiency，SCID）[13]；

T

YK2则在免疫中发挥关键作用，缺乏TYK2的小鼠可以正常发育，然而其感染分枝杆菌或病毒的风险增加， TYK2缺失的患者则表现出高IgE综合征（hyper-IgE syndrome，HIES）[14]。

1.2 Janus激酶-转录激活因子信号通路

JAK-STAT信号通路是细胞因子信号传导的重要途径，参与人体内细胞增殖、分化、凋亡及免疫调节等过程。TYK2是JAK-STAT通路中的一种关键信号转导激酶，在传递炎症因子和免疫应答信号方面具有重要的作用。如图2所示，TYK2与JAK2共同作用于IL-12和IL-23信号通路，或者与JAK1共同作用调节Ⅰ型IFN的传导[1]。IFN或IL与受体特异性结合后导致受体二聚化，随后招募JAK蛋白向受体细胞质聚集并磷酸化激活JAK。与此同时活化的JAK磷酸化STAT蛋白，STAT形成二聚体并转运至细胞核内，与目标基因启动子结合后调节特定基因的表达[15]。JAK抑制剂能够与JAK蛋白的ATP位点结合并抑制JAK的磷酸化激活，由此破坏下游的级联反应，导致自身免疫性疾病、炎症等疾病相关基因转录减少[16]。

图 2 JAK-STAT信号通路和JAK抑制剂作用机理Figure 2 JAK-STAT signaling pathway and mechanism of JAK inhibitor

1.3 酪氨酸激酶2与自身免疫性疾病

研究表明，人体生命活动中需要TYK2参与的通路，仅限于IL-12和IL-23介导的途径，IL-6或IL-10的信号传导则不需要TYK2参与，因此抑制TYK2可能是治疗免疫性疾病的有效方法[8]。值得注意的是，在高剂量脂多糖诱导的内毒素休克、肠缺血/再灌注休克、胶原诱导的关节炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎及过敏性气道炎症等模型研究中，TYK2的缺失都具有保护作用，可以增加机体对自身免疫性疾病、过敏和炎症性疾病的抵抗力[17]。全基因组关联研究表明，一种失活的TYK2突变体对包括多发性硬化症、炎症性肠病、强直性脊柱炎和银屑病在内的多种免疫性疾病具有治疗保护作用[18]。多种抗体的临床疗效证明了抑制TYK2信号通路在自身免疫性疾病治疗中的价值：1）靶向IL-12和IL-23信号通路的ustekinumab在临床上已被批准治疗银屑病、关节炎和克罗恩病[19]；2）近期临床研究表明，ustekinumab对系统性红斑狼疮患者显示出疗效[20]；3）能够特异性阻断IL-23信号传导的guselkumab可用于银屑病的临床治疗[21]。因此，TYK2是自身免疫性疾病领域的重要靶点，选择性TYK2抑制剂能取得更安全有效的临床疗效。

2 选择性酪氨酸激酶2抑制剂研究进展

鉴于TYK2在自身免疫疾病领域的突出作用，针对靶向TYK2的选择性抑制剂的研究一直在火热进行中。由于TYK2和JAK家族其他成员的激酶结构域具有高度同源性[22]，该研究充满挑战性。迄今为止，批准上市的JAK家族抑制剂主要与JH1的ATP位点结合，通过阻断ATP来抑制激酶的催化活性，从而干扰相关细胞因子信号转导，发挥治疗作用[23]。研究发现在JAK家族的 JH1 ATP位点中，有一个共同的守门氨基酸——蛋氨酸。JAK家族成员区别在于，TYK2的门控残基为异亮氨酸（Ile960），其他3个成员的门控残基是缬氨酸（Valine）[24]。这种独特的氨基酸差异为高选择性TYK2抑制剂基于结构的设计提供了依据。近年来，科学家在TYK2假激酶结构域的蛋白质结构和分子机制方面取得了重大进展，揭示了靶向TYK2 JH2的小分子可以调节相邻JH1结构域的构象，从而影响JH1的激酶活性[25-26]。研究表明，与JH2结合的小分子可以稳定JH2结构域和JH1 ATP活性位点之间的自抑制作用。而这些JH2-JH1相互作用阻碍了JH1活性位点催化所必需的氨基酸残基Tyr1054和Tyr1055的磷酸化。与TYK2 JH2结合的变构抑制剂可以在实现最大功效的同时保持较高选择性。本文将选择性TYK2抑制剂按照结构分类进行综述。

2.1 单环类

在2010年，罗氏公司开发了含有4-氨基吡啶苯甲酰胺的化合物1和化合物2作为口服选择性酪氨酸激酶2抑制剂，用于治疗银屑病和炎症性肠病[27]。通过高通量筛选得到化合物1（IL-12-pSTAT4 EC50=380 nmol · L-1），将其作为先导化合物，进行结构优化工作。在化合物1与JAK2和TYK2酶的JH1结合晶体结构中，2种酶的P-loop构象存在显著差异。与前者相比，TYK2的P-loop朝向C末端叶偏移，而化合物1结构中的苯环4位距离P-loop尖端的Glu905骨架羰基只有3.6×10-10m。因此，在化合物1的苯环4位引入氢键供体取代基可以与Glu905羰基产生作用，并可以与含有带电残基的极性区域（如Arg1027）相互作用。环丙酰胺基团与JH1结合处，JAK2与TYK2也存在残基差异，分别为谷氨酰胺（Gln853）和精氨酸（Arg901）。研究发现环丙酰胺水解和2，6-二氯苯环氧化是2种代谢途径。根据上述结论进行改造，苯环4位筛选得到最佳取代基——氰基（对TYK2的Ki为1.8 nmol · L-1），优于化合物1（Ki= 4.8 nmol · L-1）。而在环丙基引入顺式C2氟取代可以显著提高活性 （Ki= 2.5 nmol · L-1），2种改造结合得到化合物的Ki为1.4 nmol · L-1。旨在降低分子的亲脂性，选择氟原子取代苯环6位的氯原子得到化合物2（对TYK2的Ki= 1.6 nmol · L-1），能够改善TYK2的效力和选择性，维持代谢稳定。在小鼠炎症模型中，化合物2表现出对TYK2良好的抑制作用和阻断IL-12通路的潜能，以大于3 mg · kg-1的剂量经口给予化合物2可显著抑制IFN-γ。实验证明，在结构改造中不仅可以通过直接针对残基差异，还可以利用P-loop构象或灵活性的总体差异来获得药物选择性。

在2012年，Cellzome公司公开了关于嘧啶类似物作为TYK2抑制剂的专利[28]，可用于治疗免疫性疾病、过敏和炎症。活性最优的化合物3能够高效抑制TYK2活性（IC50＜100 nmol · L-1），且对TYK2选择性高于JAK2（IC50＞10 μmol · L-1）。化合物4（IC50＜100 nmol · L-1）嘧啶环的C4位被芳甲基氨基取代后对TYK2的选择性提高，对TYK2的活性超过对JAK1、JAK2和JAK3活性的100倍。

2016年，辉瑞公司公布了一系列含2，4-二氨基嘧啶环的TYK2抑制剂[29]，其中嘧啶的4位上连有含氮多元环，2位氨基与六元芳环相连的化合物5对TYK2 的IC50为774 nmol · L-1。研究者通过优化4位含氮多元环和2位氨基上的芳基或杂芳基，可以调节TYK2活性和选择性，以五元芳杂环代替六元芳环，得到化合物6，其对TYK2 的IC50为23 nmol · L-1。

2015年，Sareum公司公开了有关5-氨基-2-苯基唑-4-甲酰胺结构的TYK2抑制剂专利[30]，其用途涉及炎症和自身免疫性疾病。其中，化合物7抑制TYK2活性较好（对TYK2的IC50为1.9 nmol · L-1，对IL-23-pSTAT3的IC50为 51 nmol · L-1），超 过 其对JAK1、JAK2和JAK3酶的抑制活性（IC50分别为20、50和212 nmol · L-1）。化合物8能够有效抑制TYK2（IC50= 2.3 nmol · L-1），对TYK2的选择性高于对JAK1、JAK2和JAK3酶的活性（IC50分别为21.9、87.7和214 nmol · L-1）。最新的专利中，化合物8还可用于T细胞急性淋巴细胞性淋巴瘤的治疗[31]。

2018—2019年，百时美施贵宝（Bristol-Myers Squibb，BMS）公司公开了2项吡嗪酰胺结构的专利，保护选择性结合TYK2 JH2的变构抑制剂[32-33]。BMS通过高通量筛选得到具有烟酰胺结构的先导化合物9，其对TYK2 JH2的IC50为0.45 nmol · L-1，对TYK2/JAK1/JAK2 JH1的IC50分别为15、26和24 nmol · L-1，并采取了有效的药物化学策略，实现从先导化合物9，经化合物10和11到临床候选物12的转变[34]。化合物9引入甲基得到化合物10，其对TYK2 JH2的选择性有所提高，对TYK2 JH2 的IC50为1.3 nmol · L-1，对TYK2/JAK1/JAK2 JH1的IC50大于2 μmol · L-1。再通过引入氘增加代谢稳定性，用哒嗪环代替吡啶环增加通透性，用环丙酰胺取代减少人类Ether-a-go-go相关基因（human ether-a-gogo related gene，hERG）通道的抑制，以降低心血管反应，从而得到了化合物11，其对TYK2 JH2的IC50为1.3 nmol · L-1，对TYK2、JAK1、JAK2 JH1的IC50分别为大于50、大于2和大于50 μmol · L-1。在化合物11中引入甲基-1，2，4三氮唑和甲氧基，以提高代谢稳定性，并且与氨基酸形成重要氢键作用，增强与TYK2 JH2的亲和力，由此得到了化合物12。化合物12高选择性地与TYK2 JH2结合，其对TYK2 JH2的IC50为0.2 nmol · L-1，具有极佳的药物代谢动力学（pharmacokinetics，PK）性能，并在银屑病、结肠炎和红斑狼疮等自身免疫疾病模型中表现出极强的药效[35]。

化合物12作为新型口服选择性TYK2抑制剂，正进行关于斑块型银屑病的Ⅲ期临床试验。在已经完成的随机双盲、含安慰剂和活性对照（已上市银屑病治疗药物apremilast）的Ⅲ期临床试验POETYK PSO-1（NCT03624127）和POETYK PSO-2（NCT03611751）中，666例 和1 020例 中度至重度斑块型银屑病患者随机接受化合物12（6 mg，qd）、安慰剂或apremilast（30 mg，bid）的治疗。在治疗16周后， 服用化合物12的患者银屑病面积和严重程度指数改善75%（PASI75）比例分别为58.7%和53.6%，优于apremilast（35.1%和40.2%）以及安慰剂（12.7%和9.4%），在接受治疗24周后，这一比例提高到69%和59.3%。且有超过50%的患者皮肤症状完全或几乎完全消除。在安全性方面，化合物12的不良反应率也低于安慰剂和apremilast。这表明，化合物12有望成为银屑病患者新的治疗选择，通过口服给药是改善临床治疗的极具意义的举措[36]。BMS公司还在另外3项Ⅲ期研究（NCT04167462、NCT03924427和NCT04036435）中评估该药对其他疾病的疗效。关于系统性红斑狼疮、炎症性肠病等自身免疫性疾病的治疗应用也处于Ⅱ期临床研究中。

最近，研究人员报道了化合物13可作为与TYK2 JH2结合的TYK2抑制剂。通过对化合物13的甲基三氮唑基进行六元芳杂环取代的构效关系研究，发现对位氟原子的引入可以显著提高分子的活性（对TYK2 JH2 的IC50为0.19 nmol · L-1）和通透性，且对JAK家族的其他激酶具有高选择性。化合物13将在IL-23驱动的棘皮症、抗分化集群40（clusters of differentiation 40，CD40）诱导的结肠炎和自发性狼疮鼠模型中进行临床前研究[37]。

2.2 稠和杂环类

2015年基因泰克/罗氏公开了一项具有噻唑并[5，4-c]吡啶结构的TYK2抑制剂专利[38]，代表性化合物14（Ki= 0. 2 nmol · L-1）有效抑制TYK2活性，可用于哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎、银屑病的治疗。

同年，Jang等[39]通过基于片段的药物设计（fragment-based drug design，FBDD）发现了一种高效的TYK2抑制剂化合物15可以用来治疗类风湿关节炎。其完全抑制了由IFN-α介导的TYK2/STAT3信号传导途径以及下游磷酸化转录激活因子3（phosphorylation signal transducers and activators of transcription 3，pSTAT3）的表达，效果超过阳性化合物tofacitinib。

2017年，辉瑞公司基于TYK2 JH1 ATP位点的结构基序，开发了具有不同[5，6]-稠合杂环结构的化合物[24]。其中具有吡唑并[1，5-a]吡嗪环类化合物是有效的TYK2抑制剂[40]。化合物16在表现出一定TYK2选择性抑制活性的同时（TYK2 IC50= 10 nmol · L-1），具有较好的肝微粒体清除率（HLM） 为18 L · min-1· mg-1和亲脂性（LipE）为5.5。在此基础上，用环丁烷替代氮杂环丁烷得到了化合物17，共晶结构表明（见图3），顺式环丁腈部分与TYK2残基存在关键氢键和静电作用，能选择性抑制TYK2活性（IC50= 15 nmol · L-1），并大大降低肝微粒体清除率（HLM＜8 L · min-1·mg-1）并提高通透性。在咪喹莫特诱发的皮炎小鼠模型中，化合物17能有效抑制IL-12分泌，灌胃给药分别为 1、3、10、 30 mg · kg-1（qd）时，IL-12 抑制率分别为51%、77%、 94%、98%。目前，化合物17作为选择性强效TYK2抑制剂，正在进行斑块型银屑病（NCT03895372）、溃疡性结肠炎（NCT04209556）和化脓性汗腺炎（NCT04092452）的临床研究。

图 3 化合物17与TYK2共晶结构[24]Figure 3 Co-crystal structure of compound 17 and TYK2

同年，BMS公司开发了具有咪唑[1，2-b]并哒嗪结构的化合物18（TYK2 JH2 IC50= 4 nmol · L-1），目前正在研究中，用于炎症和自身免疫性疾病的治疗[41]。

2018年，Nimbus Therapeutics公布了具有[5,6]-稠合多氮芳杂环结构的TYK2抑制剂专利[42]，其中的活性最佳化合物19能有效抑制TYK2活性（TYK2 JH2 IC50＜1 nmol · L-1），在雄性比格犬中以10 mg · kg-1经口给药，表现出良好的PK性质：血浆药物浓度-时间曲线下面积（AUC）为18 747 ng · mL-1· h，固有清除率（clearance，CLint）为0.62 mL · min-1· kg-1。目前Nimbus Therapeutics公司有2款TYK2抑制剂NDI-031301和NDI-031407 （结构未知）处于临床前研究中。TYK2的活化有利于T细胞急性淋巴细胞白血病（T-lymphocyte acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）细胞的异常存活。NDI-031301是一种有效的选择性TYK2抑制剂，可抑制T-ALL细胞的增殖。给接种KOPT-K1 T-ALL细胞的免疫缺陷小鼠经口给药NDI-031301 100 mg · kg-1，可显著降低肿瘤负荷，提高生存效益[43]。NDI-031407在体外能够有效阻断TYK2介导的IL-23信号传导，并在小鼠模型中有效地抑制脊柱性关节炎（spondyloarthritis，SpA）的发展，因此其可作为潜在的治疗SpA的口服TYK2抑制剂[44]。

2019年，Abbvie公司宣布ABBV-712（结构未知）作为选择性TYK2抑制剂，开启银屑病Ⅰ期临床试验。在Abbvie公布的专利中[45]，化合物20能有效抑制TYK2活性（EC50= 14 nmol · L-1），选择性高于JAK1（EC50= 3.4 μmol · L-1）和JAK2（EC50＞25 μmol · L-1），适应证为银屑病和炎症性肠病。

同年，Sasaki等[46]报道了具有2，4-二氨基吡啶结构的新型大环类TYK2抑制剂。将化合物21吡咯烷酮环的4位与远端吡啶通过柔性饱和烷基键相连，可以保持化合物与TYK2的关键氢键作用（TYK2 IC50= 1.1 nmol · L-1、JAK1 IC50= 120 nmol · L-1、JAK2 IC50= 44 nmol · L-1、JAK3 IC50= 68 nmol · L-1）。其中大环化合物22对TYK2显示出强大的效力和极好的选择性（TYK2 IC50= 4.9 nmol · L-1、TYK2/JAK1活性比＞140、TYK2/JAK2活性比＞27、TYK2/JAK3 活性比＞82），对IL-23也表现出较强的抑制活性（IC50= 210 nmol · L-1）。这些大环类TYK2抑制剂为选择性TYK2抑制剂的合成提供了新的设计思路（见图4）。

图 4 大环类TYK2抑制剂设计思路Figure 4 Ideas for the design of macrocyclic TYK2 inhibitors

翰森医药近期也公布了一项选择性TYK2抑制剂专利，主要用途涉及皮炎、银屑病、类风湿关节炎、炎症性肠病、癌症等疾病[47]。代表化合物23结构与化合物13相似，差别在于吡啶环的C2与酰胺通过甲基相连形成[5，6]-稠合芳杂环结构。在人骨髓瘤细胞中，化合物23能有效抑制IFN-α TYK2-STAT3通路磷酸化信号传导（IC50= 1.25 nmol · L-1），对TYK2选择性高于JAK2调控的IL-6-pSTAT3途径（IC50= 88 nmol · L-1）。在雄性BALB/c小鼠经口给药试验中（5 mg · kg-1），化合物23表现出较好的PK性质[AUC = 3 654 ng · mL-1· h，半衰期（T1/2）= 2.5 h]。

3 结语与展望

近年来，TYK2作为JAK-STAT信号转导通路的关键激酶已在自身免疫疾病领域进行广泛的研究。选择性抑制TYK2，能够减少对机体其他免疫相关途径的抑制，降低感染风险，在临床上更加具有安全性。尽管暂时没有选择性TYK2抑制剂上市，但其能够在类风湿关节炎、强直脊柱炎、炎症性肠病、银屑病等自身免疫性疾病方面发挥独特作用，具有巨大的开发潜力。目前，小分子化合物12处于Ⅲ期临床试验阶段并且治疗效果显著、化合物17进入Ⅱ期临床试验阶段，有多个小分子在Ⅰ期临床及临床前生物活性测试阶段。相信不久之后，将会有选择性TYK2抑制剂成功上市，造福广大自身免疫疾病患者。