山东核桃良种SSR指纹图谱及分子身份证的构建——基于毛细管电泳分析

梁 燕，韩传明，周继磊，孙 超，王翠香，李春明，王 静，闵旭峰，公庆党，孟晓烨，杨绪强

（1山东省林业科学研究院，济南 250014；2山东省林业保护和发展服务中心，济南 250014；3海阳市林业站，山东 海阳 265100；4枣庄市山亭区自然资源局，山东 枣庄 277500；5济南市长清区文昌林业站，济南 250300）

0 引言

核桃(Juglans regiaL.)作为中国主要的经济林树种之一，也是重要的木本油料树种，具有极高的经济价值，其根、茎、叶、果皆具有很好的医疗保健功效[1]。核桃营养丰富，在中国被誉为“长寿果”，每100 g核桃中，含脂肪55.26～72.14 g，核桃中的脂肪43.59%～62.50%为亚油酸，2.36%～9.22%为亚麻酸，蛋白质为12.43～21.03 g，而且核桃含有丰富的矿物元素和维生素[2-3]。近年来，随着退耕还林政策的实施，核桃产业发展迅猛[4]，据不完全统计，2020年山东省核桃产量达到17.39万t，面积达到13.64万hm（2数据由山东省经济林管理站统计），随着产业的发展，核桃品种越来越多，亲缘关系较近及苗期的核桃各品种之间表型性状差异较小，核桃在品种培育和推广中出现“同名异物”和“同物异名”的情况，这样不利于核桃良种的推广[5]。

指纹图谱是指能够反映生物个体间差异的电泳图谱，由于它具有类似人类指纹的高度个体特异性和稳定可靠性，故被称为“指纹图谱”，运用DNA指纹图谱能进行品种的真实性和纯度鉴定，确定品种的亲缘关系，以及用于新品种登记和品种知识产权保护等[6]。SSR分子标记具有标记数量丰富，具有广泛分布于各条各染色体上的等位变异；共显性标记，呈孟德尔遗传；技术重复性好，易于操作，结果可靠的特点[7]。SSR技术现今成熟应用于核桃遗传多样性分析、杂交育种中亲缘关系分析、实生选育中的分子图谱建立、品种鉴定等方面[8-9]。荧光标记SSR毛细管电泳检测法可以得到目标DNA片段的准确大小，稳定、准确、高效[10]，基于此，实验采用荧光标记SSR毛细管电泳检测法构建核桃指纹图谱。

近年来，针对核桃品种遗传多样性的研究较多，但区域性核桃品种特别是主栽品种指纹图谱的构建较少，品种身份证的建立更是鲜见报道，而农业中小麦、甜菜、大豆、油菜等分子身份证的构建已经较为成熟[10-13]，鉴于此，本文参照小麦等指纹身份证的构建方法对山东省17个核桃品种指纹图谱与分子身份证的构建进行探讨，为解决生产中种源信息混乱、品种难以鉴别等问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2019年4月从山东省林业科学研究院核桃种质资源圃采集17个山东省主要栽植的核桃品种（表1）外围嫩叶，硅胶干燥，带回实验室备用。

表1 核桃品种名称及特征

续表1

1.2 DNA提取及SSR-PCR扩增

DNA采取改良的CATB法提取，并在紫外分光光度计下检测DNA质量，-20℃保存。从已报道的文献[14-16]中选择40对黑核桃和核桃中开发的引物进行预试验，荧光引物由山东华博基因工程有限公司合成，筛选出15对多态性较高的引物试验（表2）。SSR-PCR反应体系为 20 μL，其中 2 ×TaqPCR Mix 10 μL，Forward Primer 1.2 μL，Reverse primer 1.2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 5.6 μL；SSR-PCR扩增程序为94℃预变性3 min，94℃变性30 s，53℃退火，72℃延伸，34个循环，72℃延伸10 min，4℃保存待电泳检测。PCR扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离拍照。

表2 15对SSR引物信息及样品区分情况

1.3 数据统计与分析

用Gene Marker 2.2.0进行峰图的获取和数据处理，可确定目标样品SSR扩增片段的精确长度。利用NTSYS-pc2.1进行遗传相似系数的计算和UPGMA聚类分析，绘制亲缘关系聚类图，利用EXCEL2013进行数据分析。参考秦瑞英等[10]构建小麦品种身份证的方法构建核桃品种身份证（分为3个部分），每对引物扩增出的不同片段长度按照出峰个数由少到多，相同个数按照片段由小到大，依次标注为1、2、3……9、A、B、C……，按标记所在染色体的顺序排列，构建指纹特征码。

2 结果与分析

2.1 17个核桃品种遗传相似系数及聚类分析

由表3中分析可知，17个核桃品种间Nei’s遗传距离0.181～0.720，变幅为0.539，遗传相似系数为0.267～0.867，变幅0.6，遗传基础较广；其中‘日丽’与其他各品种的遗传距离为0.402～0.720，遗传相似系数为0.333～0.667，二者结果一致‘，日丽’与其他品种遗传距离均较大，血缘关系较远，在杂交育种中可利用；‘青林’与‘丰辉’品种间遗传相似系数最小，‘元丰’与‘岱丰’品种间遗传相似系数最大。

表3 17个核桃品种间Nei’s遗传距离（左下角）与相似系数（右上角）

续表2

基于17个核桃品种的遗传相似系数聚类（图1），在遗传相似系数0.5处，17个核桃品种聚为2大类，除‘奥林’、‘岱香’其余15个品种聚为Ⅰ类，但聚类结果并未按照早实、晚实聚类。类群Ⅰ中‘日丽’、‘青林’为山东核桃实生后代聚在一起，与‘鲁锦’、‘鲁果2号’血缘相近，‘丰辉’的实生后代‘丰硕’、‘岱丰’先与‘元丰’、‘元林’聚在一起后再与‘丰辉’聚类，‘元林’是‘元丰’的后代，‘元丰’与‘岱丰’品种间遗传相似系数达到0.867，‘鲁果5号’、‘鲁核1号’为早实核桃实生后代，血缘关系相近的聚在一起，说明基于SSR分子标记的聚类结果可信度较高；分析发现Ⅰ群中‘青林’、‘野香’、‘鲁核1号’为速生、果材兼用核桃[1]，其余品种基本树体高大[1,17-19]，‘野香’为野核桃与核桃杂交，这里与核桃组的14个品种聚在一起，与核桃组血缘关系更近。Ⅱ群‘岱香’品种为‘辽宁1号’ב香玲’杂交育成，表现出矮化紧凑性状，对‘岱香’这方面性状可进行开发，‘奥林’为山东核桃实生选育，传统分类中‘奥林’为晚实，‘岱香’为早实核桃[19-21]，两个品种聚在一起，相关血缘关系较近。

图1 17个核桃品种遗传相似系数UPGMA聚类图

2.2 指纹图谱构建与编码

毛细管电泳峰图如图2。15对引物鉴别能力（表2）HF15＞HF14＞HF3=HF9＞HF12＞HF4＞HF8＞HF1＞HF2 ＞HF7＞HF6＞HF5＞HF11＞HF10，HF15将 17个核桃品种分为10组，可单独鉴别品种6个(H02、H05、H06、H07、H09、H11)，HF14也可将17个核桃品种分为10组，单独鉴别品种4个(H01、H05、H06、H13、H18)，鉴别能力较差的引物为HF10与HF11，将17个核桃品种分为3个组。

图2 引物HF15不同核桃品种扩增产物峰图

林木特征指纹图谱的构建讲究利用尽量少的引物组合鉴别尽量多的品种，达到程序简单而又经济的目的[5]，品种鉴别能力较好的引物有 HF3、HF9、HF12、HF14、HF15，5对核心引物PIC为0.621～0.756，均大于0.5，多态性很好，且HF9+HF15，HF3+HF9+HF14均可将17个核桃品种完全区分开，两组引物可相互印证，因而将这5对SSR引物选作核心引物构建17个核桃品种的特征指纹图谱（表4）。并以此为基础编制17个品种的特征指纹码。

表4 17个核桃品种特征指纹图谱

2.3 品种分子身份证构建

品种身份证由3部分构成，第1部分为商品码，包括品种类别、品种审定区域、时间；第2部分指纹码；第3部分为补充码（T-转基因、S-分子育种、M-诱变育种、N-常规育种）[10]。以‘日丽’为例，其19位分子身份证号码为020201370201133332N，果树(02)-坚果类(02)-核桃(01)-初次审定省份（山东370）-初次审定时间(2011)-特征指纹码(33332)-常规育种(N)。

表5 17个核桃品种分子身份证与二维码

续表5

3 讨论与结论

17个核桃品种间Nei’s遗传距离0.181～0.720，变幅为0.539，遗传相似系数为0.267～0.867，变幅0.6，二者变幅均较大，说明供试材料的遗传基础较宽[5]；17个核桃品种基于SSR分子标记聚类结果，品种并未按照早实与晚实核桃分类，在分子和基因层面可进一步研究探讨影响核桃结果时间的因素，寻找与其相关联的标记引物；传统分类将核桃分为3组20多个种[7]，而组间杂交出的品种归属讨论较少，DNA标记在分子层面将传统分类难以解决的问题细化解决，为植物分类提供更好的证据。核桃组内分类传统往往按照坚果性状分类，对树体等性状考虑较少，随着育种方向的多样化，分类也将更为科学，SSR分子标记聚类结果为育种与选种提供更加科学的选择参考‘，岱香’品种为‘辽宁1号’ב香玲’杂交育成[20]，表现的矮化性状在生产实践具有参考意义‘，奥林’与其亲缘关系较近，是山东核桃实生后代，两个品种聚在一起‘，香玲’为‘上宋6号’ב阿克苏9号’杂交育成[17]，两个品种的来源可进一步研究；自19世纪60年代，山东引进新疆核桃[1]，从品种的来源分析，山东区域核桃与新疆核桃、北方核桃进行了广泛的基因交流，聚类中地理来源问题较为复杂，分析中发现山东主栽核桃品种与南方核桃基因交流较少，也为以后育种提供了方向。

构建品种的特征指纹图谱和分子身份证是解决市场和育种中品种混乱，良种推广混乱的有效方法。地域性核桃良种指纹图谱构建较少，史丽会等[22]筛选出15个微卫星位点表现出较好的品种鉴别能力，为川早系列核桃品种的鉴定提供了基础，周于波等[5,23]利用SSR分子标记构建了11个四川核桃良种和11个川西南泡核桃良种的指纹图谱，陈凌娜[24]用4对SSR引物构建了35个核桃主栽品种的指纹图谱，山东地区核桃良种的指纹图谱未见报道，实验采用的陈少瑜和高玉娜[14-16]等文献中的15对引物在山东省核桃品种鉴定中表现良好，筛选出5对高鉴别能力SSR引物，并构建了17个核桃品种的指纹图谱，为山东地区核桃良种的鉴别提供了技术基础，5对核桃引物与周于波[5,23]和陈凌娜[24]的研究的核心引物不同，他们也未进一步就核桃指纹图谱的商业应用进一步探讨，这也为下一步研究提供方向。

李国田等[4]利用ISSR分子标记方法，从28条引物中筛选出10条引物构建了16个核桃品种的分子身份证，遗传距离为0.20～0.87，结果与本研究基本一致；而本研究采用SSR荧光标记与毛细管检测相结合的方法，确定出不同样品SSR扩增片段的精确长度，在技术手段上更进一步，且筛选出的5对核心引物精简了分子身份证的构建方法，符合最少引物区分最多品种的原则，5对核心引物PIC均值0.697，理论上可区分最大品种数1.05×106[25-26]，满足生产中的需求。本研究在品种身份证构建中加入了品种商品性信息，并生成了品种的二维码，但还不能完全满足实际需要，可将具体生产时间、地点、物流信息加入到电子码中，在品种外包装中标识，实现品种信息的全追溯。由于材料为山东省栽种的核桃良种，材料范围较窄，对核桃新品种，特别是现在种间杂交的新品种，以及其他省份的良种分子身份证应用未进行研究，现在商品流通范围广，研究下一步将扩大范围，在现有的基础上，探讨研究应用更广的SSR引物和全国范围核桃分子身份证构建的可能性。

综上所述，本研究中采用15对SSR引物分析山东省主栽的17个良种的遗传背景，发现其遗传相似系数为0.267～0.867，变幅0.6，17个良种具有丰富的遗传多样性；筛选出5对核心引物构建17个良种的特征指纹图谱和分子身份证，5对核心引物可分为2组相互印证，进一步探讨了将分子标记运用到山东核桃良种的鉴定和商品信息追溯的方法，创新生成了品种分子二维码。SSR分子标记基于毛细管电泳手段精确且技术成熟，方法简便可行，本研究可为全国范围内核桃良种的鉴定与分子身份证的构建提供参考。