一株巨大芽孢杆菌发酵培养基的优化及解磷效果研究

杨晓燕，叶伟伟，魏善强，张 龙，黄 俊

（山东劲牛集团股份有限公司，济南 250000）

0 引言

磷是植物生长所必需的大量营养元素之一，是植物体内重要化合物的组成元素，在植物的生长、发育、遗传、繁殖等生命活动中都具有重要作用，是决定植物的花芽分化、花粉发育的重要因素，也是生殖生长与营养生长所必须的元素。土壤中含有丰富的含磷物质，它们主要以稳定的铝硅酸盐和磷灰石状态存在[1]，95%以上的磷很难被植物直接吸收利用[2]，而能被植物直接吸收利用的有效态无机磷很低，一般只占全磷量的2%～3%[3]。为了保持农作物的产量人们大量地使用化学肥料来给予土壤充足的养分，随着时间的积累，反而使土壤恶化状况更加严重，人们不得不开始寻找新的方法解决土壤问题。自然界中有些微生物具有解磷功能，可释放出土壤中固定态无效磷，这样不仅能够增加作物磷素吸收量，提高作物产量，还能大大提高磷肥利用率，减少农业化学污染。因此，使用解磷菌菌肥是实现农业生产绿色持续发展的重要途径之一。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)是一种植物根系促生细菌[4]，是有益菌，具有对环境和人畜无害等特点，是微生物肥料中的常用菌种之一；具有解磷功能，对卵磷脂、土壤中植物无法直接吸收利用的有机磷、无机磷有明显的分解作用，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态[5]，可以提高土壤肥力[6-7]，增加作物的产量[8-9]。20世纪30年代，苏联科学家从土壤里分离到了一株可以解磷的巨大芽孢杆菌，开始投入生产并进行相关研究。而巨大芽孢杆菌具体的解磷机制、作用效果、发酵方法等领域的研究，近几十年才进行的比较深入。常规发酵培养基多采用玉米粉、豆粕粉及其他农副产品等[10-11]作为主要原料，培养条件一般为温度30℃左右，摇床转速200 r/min左右，初始pH 7.0～8.0等[12-13]，有效活菌数在10×108cfu/mL左右，但是在工业生产过程中，由于发酵条件的放大，不同菌株间的差异性，液体发酵极易被污染，且有效活菌数不稳定，达不到实验室水平，不能满足生产发展的需要。本文主要研究从土壤中分离的一株巨大芽孢杆菌，通过单因素试验和正交试验优化其发酵培养基及发酵条件，对其进行中试试验，并对其解磷机制进行研究，为巨大芽孢杆菌应用到生产实践中提供强有力的理论基础依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)，实验室前期筛选。

1.2 培养基

1.2.1 种子培养基和初始培养基 LB培养基（胰蛋白胨1%，氯化钠1%，酵母粉0.5%，蒸馏水1000 mL）。

1.2.2 无机磷培养基 葡萄糖10 g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO4·7H20 0.3 g、NaC1 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·7H2O 0.03 g、Ca3(PO4)25 g、蒸馏水1 L，pH 7.0。

1.2.3 有机磷培养基 葡萄糖10 g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaC1 0.3 g、KC1 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·7H2O 0.03 g、卵磷脂2 g、CaCO35 g、蒸馏水1 L，pH 7.0[14]。

1.3 巨大芽孢杆菌发酵条件的优化

1.3.1 不同碳源对有效活菌数的影响试验 选用不同的碳源，分别以糖蜜、葡萄糖、玉米粉、蔗糖、可溶性淀粉和麸皮代替酵母粉作为碳源，其浓度均为10 g/L，配方中其他成分同原始发酵培养基。接种量为2%，装液量为20%，摇床30℃、200 r/min振荡培养，达到芽孢率95%后，利用平板计数法[15]测定发酵液中有效活菌数，比较不同碳源对有效活菌数的影响。

1.3.2 不同氮源对有效活菌数的影响试验 选用不同的氮源，分别以豆粕粉、硫酸铵、尿素、牛肉膏、硝酸钾和蛋白胨代替胰蛋白胨作为氮源，其浓度均为10 g/L，配方中其他成分同原始发酵培养基。其他发酵条件为：接种量为2%，装液量为20%，温度30℃，转速200 r/min振荡培养，达到芽孢率95%后，利用平板计数法测定发酵液中有效活菌数，比较不同氮源对有效活菌数的影响。

1.3.3 不同无机盐对有效活菌数的影响试验 选用不同的无机盐，分别为硫酸锰、碳酸钙、硫酸钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁和氯化钙作为无机盐，其浓度均为0.5 g/L，配方中其他成分同原始发酵培养基。其他发酵条件为：接种量为2%，装液量为20%，温度30℃，转速200 r/min振荡培养，达到芽孢率95%后，利用平板计数法测定发酵液中有效活菌数，比较不同无机盐对有效活菌数的影响。

1.3.4 正交试验优化发酵培养基 为了进一步确定单因素中各因素的发酵最适浓度，进行正交试验优化发酵培养条件（表1）。

表1 L9(33)正交设计编码值及水平 g/L

1.3.5 初始pH对有效活菌数的影响试验 选择pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，其他发酵条件为：接种量为2%，装液量为20%，温度30℃，转速200 r/min振荡培养。

1.3.6 发酵温度对有效活菌数的影响试验 选择22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃和36℃作为发酵温度，其他发酵条件为：接种量为2%，装液量为20%，pH 6.5，转速200 r/min振荡培养。

1.3.7 接种量对有效活菌数的影响试验 选择2%、4%、6%、8%、10%和12%作为接种量，其他发酵条件为：装液量为20%，温度30℃，pH 6.5，转速200 r/min振荡培养。

1.3.8 转速对有效活菌数的影响试验 选择140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min和220 r/min作为培养转速，其他发酵条件为：接种量为2%，装液量为20%，温度30℃，pH 6.5，振荡培养。

1.4 巨大芽孢杆菌对磷的降解效果

1.4.1 巨大芽孢杆菌对有机磷的降解效果 用接种环挑取单菌落接种到50 mL液体LB中，30℃、200 r/min振荡培养17 h，以2%的接种量接入有机磷培养基中，对照接入灭活菌液，每组3个平行，接种后，30℃，200 r/min条件下振荡培养5天，离心机离心，使用钼锑抗比色法测定上清液中有效磷含量[16-17]。每天测量记录有效磷浓度。

1.4.2 巨大芽孢杆菌对无机磷的降解效果 用接种环挑取单菌落接种到50 mL液体LB中，30℃、200 r/min振荡培养17 h，以2%的接种量接入无机磷培养基中，对照组接入灭活菌液，每组3个平行，接种后，30℃，200 r/min条件下振荡培养5天，离心机离心，使用钼锑抗比色法测定上清液中有效磷含量。每天测量记录有效磷浓度。

1.5 田间试验验证巨大芽孢杆菌对土壤的解磷效果

1.5.1 试验设计 试验田设2个处理，重复3次，小区面积45 m2，随机排列，小区设立保护行1.5 m；在刚施入肥料和菌剂时和处理完成2周时对土壤分别进行取样，测定其有效磷含量；施入肥料和菌剂2周，种植番茄。具体处理如下：

处理1：常规施肥；

处理2：常规施肥+微生物菌剂（巨大芽孢杆菌20亿/g）(600 kg/hm2)。

1.5.2 土壤有效磷的测定方法 采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定土壤有效磷的含量。

2 结果与分析

2.1 巨大芽孢杆菌发酵条件的优化

2.1.1 不同碳源对有效活菌数的影响试验 不同碳源对巨大芽孢杆菌有效活菌数的影响，如图1所示，糖蜜、玉米粉、麸皮作为巨大芽孢杆菌液体发酵培养基的碳源比较好，其活菌数均高于5×108cfu/mL，明显高于对照组有效活菌数3×108cfu/mL。结果表明巨大芽孢杆菌液体发酵的最佳碳源是麸皮，其次是糖蜜。麸皮价格不仅远远低于糖蜜且易获得，考虑到大规模工业化生产的成本问题，选用麸皮作为巨大芽孢杆菌液体发酵的碳源。

图1 碳源对巨大芽孢杆菌有效活菌数的影响

2.1.2 不同氮源对有效活菌数的影响试验 不同氮源对巨大芽孢杆菌有效活菌数的影响，如图2所示，豆粕粉、牛肉膏、硝酸钾、蛋白胨作为巨大芽孢杆菌液体发酵培养基的氮源比较好，其活菌数均高于6×108cfu/mL，明显高于对照组有效活菌数3.8×108cfu/mL。结果表明巨大芽孢杆菌液体发酵的最佳碳源是豆粕粉和牛肉膏，其次是硝酸钾和蛋白胨。使用豆粕粉作为氮源，巨大芽孢杆菌的有效活菌数增加最多，且其价格比牛肉膏便宜，故选用豆粕粉作为巨大芽孢杆菌液体发酵的氮源。

图2 氮源对巨大芽孢杆菌有效活菌数的影响

2.1.3 无机盐对有效活菌数的影响试验 不同无机盐对巨大芽孢杆菌有效活菌数的影响，如图3所示，可以看出硫酸锰、碳酸钙、硫酸钾和磷酸氢二钾作为无机盐对巨大芽孢杆菌的生长有一定的促进作用，其生长量分别为对照组的6、5、2、1.4倍。其中硫酸铵、硫酸镁和氯化钙作为无机盐对巨大芽孢杆菌的生长有明显的抑制作用。虽然碳酸钙比硫酸锰价格便宜，但因其不易溶于水，产生沉淀，可操作性差，且化学状态不稳定易分解产生CO2，而生产过程中无机盐使用量少，其价格对生产成本影响较小，考虑到使用硫酸锰作为无机盐对巨大芽孢杆菌的生长促进作用最强，故选用硫酸锰作为巨大芽孢杆菌液体发酵的氮源。

图3 无机盐对巨大芽孢杆菌有效活菌数的影响

2.1.4 正交试验优化培养条件 利用L9(33)正交表对其进行培养基的优化，麸皮、豆粕粉、MnSO4共3个因素对巨大芽孢杆菌的生长影响较大，故选用这3个因素进行正交实验。实验结果与分析见表2，最佳组合为麸皮5 g/L、豆粕粉10 g/L、MnSO40.5 g/L，主要影响因子为豆粕粉，其次为麸皮，MnSO4对试验结果影响较小。根据方差分析（表3），麸皮、豆粕粉在α=0.05水平上对实验结果的影响存在显著性差异。

表2 正交试验结果

表3 方差分析

2.1.5 初始pH对有效活菌数的影响试验 如图4所示，随着pH的增加菌数呈现先增加后降低的趋势，当pH7.0时，巨大芽孢杆菌生长最好，有效活菌数最高。在pH≤6和pH≥7.5条件下，有效活菌数明显下降，说明强酸碱条件不利于巨大芽孢杆菌生长。

图4 初始pH值对巨大芽孢杆菌有效活菌数的影响

2.1.6 发酵温度对有效活菌数的影响试验 如图5所示，随着温度升高，巨大芽孢杆菌的有效活菌数呈先增加后降低的趋势，当温度为30℃时，有效活菌数最高；而当温度大于34℃时极易被环境中其他芽孢杆菌所代替。

图5 发酵温度对巨大芽孢杆菌有效活菌数的影响

2.1.7 接种量对有效活菌数的影响试验 如图6所示，接种量在2%～6%范围内时，接种量对巨大芽孢杆菌有效活菌数影响不明显，当接种量为8%时，巨大芽孢杆菌生长最好，有效活菌数最高。

图6 接种量对巨大芽孢杆菌有效活菌数的影响

2.1.8 转速对有效活菌数的影响试验 如图7所示，当转速为200 r/min时，巨大芽孢杆菌有效活菌数最高，所以最佳发酵转速设为200 r/min。

图7 转速对巨大芽孢杆菌有效活菌数的影响

2.1.9 50 L发酵罐发酵验证 按优化条件上罐，定容至30 L，121℃灭菌30 min，加消泡剂0.15%，用氨水调pH 7.0，培养温度30℃，搅拌转速200 r/min，当菌数不再上升，芽孢率达95%以上视为发酵结束。巨大芽孢杆菌发酵26 h基本达到终点，活菌数达48.0×108cfu/mL，芽孢率达95%以上，芽孢照片如图8所示。

图8 巨大芽孢杆菌芽孢照片

2.2 巨大芽孢杆菌对磷的降解效果

2.2.1 巨大芽孢杆菌对有机磷的降解效果 从图9中可以看出，巨大芽孢杆菌对有机磷卵磷脂的分解能力很强，在巨大芽孢杆菌培养过程中，在1～3天过程中，培养基中有效磷含量上升最快，在第4天时，卵磷脂中的磷被巨大芽孢杆菌分解释放达到最高值，有效磷的含量为1.67 mg/L，是对照组含量的约26倍，培养后期有效磷含量趋于平稳。培养基接入灭活菌液作为对照组，在整个4天的培养过程中，有效磷的含量在

图9 巨大芽孢杆菌对有机磷的降解效果

2.3 田间试验验证巨大芽孢杆菌对土壤的解磷效果

2.3.1 巨大芽孢杆菌对土壤的解磷效果 在刚施入肥料和菌剂时，测得土壤的有效磷含量为132.8 mg/kg；处理完成2周时，测得土壤的有效磷含量为165.3 mg/kg。结果说明巨大芽孢杆菌对土壤的解磷效果非常明显，0.065 mg/L左右。

2.2.2 巨大芽孢杆菌对无机磷的降解效果 从图10中可以看出，巨大芽孢杆菌具有较强的分解Ca3(PO4)2的能力，在整个培养过程中，第1天培养基中的有效磷含量上升最快，在第3天后，巨大芽孢杆菌对Ca3(PO4)2中磷的释放趋于平稳，有效磷的含量约为83 mg/L，是对照组含量的17倍。对照组培养基接入的是灭活菌液，在整个试验过程中有效磷的含量基本维持在5.0 mg/L左右。可以明显提高土壤有效磷含量。

图10 巨大芽孢杆菌对无机磷的降解效果

2.3.2 巨大芽孢杆菌对番茄生物学性状的影响 处理2与处理1相比，株高增加，叶片浓绿肥厚，单果重明显增加（见表4）。说明施用巨大芽孢杆菌通过解磷作用能够明显提高农作物的品质，增加农作物的产量，对农业生产具有重要意义。

表4 生物学性状及品质统计表

3 讨论

巨大芽孢杆菌是一种功能性有益菌，其对环境无污染、对植物安全、对人畜无害，受到人们广泛的关注和系统的研究[18]。同时，具有较强的解磷作用，而磷是植物生长所必需的微量元素，是核酸、磷脂及糖代谢中间产物的重要组成成分，为植物生长发育提供所能量[19]。20世纪中叶，为了解决农作物产量低和土壤缺磷问题，人们开始对巨大芽孢杆菌进行一系列相关研究，并将其作为提高作物产量、土壤有效磷含量的解磷微生物肥料生产使用[20]。

近年来，随着微生物菌剂在农业生产上的广泛应用，巨大芽孢杆菌以其在土壤中的解磷作用而被深入研究，并将其优化培养生产为微生物菌剂使用。解磷微生物进入土壤后定殖在植物根际系统，通过自身的生长繁殖来改善土壤，提高土壤有效磷含量，增加作物产量，所以农作物生长过程中使用解磷菌是土壤中无效磷转化为有效磷的最安全高效的方式之一，可以促进植物的生长发育，促使植物能够适应碱化、酸化及缺磷的不良土壤环境[21-24]。研究发现，碳源、氮源及Mn2+、Ca2+、K+、NH4+、Mg2+等离子对巨大芽孢杆菌的发酵具有明显的影响[25]，能够促进其生长繁殖和提高芽孢率，但是通常有效活菌数仅能达到10亿左右，芽孢率在90%左右，并且在实际生产时往往低于实验室水平；而且巨大芽孢杆菌相对敏感，很容易被其他芽孢杆菌污染，在工业生产中对工艺参数要求较高，需要各种条件匹配。本研究通过改变培养基组分和发酵条件对巨大芽孢杆菌的发酵工艺进行优化，在实验过程中发现使用麸皮可以大幅度提高有效活菌数及其芽孢率，并且降低工业发酵生产污染率，生产成本也能得到极大降低。使用钼锑抗比色法测定有机磷和无机磷含量研究巨大芽孢杆菌的解磷效果；通过田间试验也验证了巨大芽孢杆菌对土壤的解磷效果，番茄使用巨大芽孢杆菌菌剂后，株高增加，叶片浓绿肥厚，单果重明显增加，说明施用巨大芽孢杆菌通过解磷作用能够明显提高农作物的品质，增加农作物的产量，对农业生产具有及其重要的意义。

后续我们将在前期工作基础上继续深入研究巨大芽孢杆菌的发酵条件、放大工艺及其制粉工艺，在保证高芽孢率的基础上获得最高有效活菌数，目的是降低工业生产成本，增加产量；再通过研究巨大芽孢杆菌与其他菌株的拮抗作用，进行菌株间的优势互补，以期开发出高效复合多功能的系列微生物菌剂，能够更好地为农作物的优质生产提供强有力保障。

4 结论

本研究通过单因素实验和正交实验，发现巨大芽孢杆菌的最佳培养基组成为：麸皮10 g，豆粕粉5 g，氯化钠10 g，MnSO40.5 g，H2O 1000 mL，pH 7.0，培养温度30℃，接种量为8%，培养时间26 h，转速200 r/min。主要影响因子为豆粕粉，其次为麸皮，根据方差分析，麸皮、豆粕粉在α=0.05水平上对实验结果的影响存在显著性差异。采用优化条件上罐，30℃培养26 h进入稳定期，有效活菌数48×108cfu/mL，芽孢率达95%以上。本实验中巨大芽孢杆菌具有较强的解磷能力，在第4天时，巨大芽孢杆菌对卵磷脂中磷的释放达到最大值，有效磷的含量为1.67 mg/L，是对照组含量的约26倍；在第3天时，巨大芽孢杆菌对Ca3(PO4)2中磷的释放趋于平稳，有效磷的含量约为83 mg/L，是对照组含量的17倍；说明该菌株从有机磷和无机磷中释放有效磷的效果比较明显。通过田间试验也验证了巨大芽孢杆菌对土壤的解磷效果，在刚施入肥料和菌剂时，土壤的有效磷含量为132.8 mg/kg；处理完成2周时，土壤的有效磷含量为165.3 mg/kg。通过对巨大芽孢杆菌发酵培养基的优化及解磷效果的研究，发现该菌株能够将土壤中固化的不易利用的磷释放为作物快速吸收利用的有效磷，降低化肥的使用，减少土壤化学污染；为巨大芽孢杆菌的深入研究和工业化应用提供了强有力的理论依据。