一株基于高通量测序降解亚硝酸盐芽孢杆菌的筛选

孙全敏，马明昊，迟雪梅，迟乃玉，张庆芳*

(1.大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622；2.辽宁省海洋微生物 工程技术研究中心，辽宁 大连 116622)

根据研究，摄入过量亚硝酸盐会降低血液的携氧能力，引起身体组织缺氧，同时具有一定的致畸性，可以导致发育缺陷[1]。亚硝酸盐也是营养物污染的一种普遍形式，通常从各种来源排放到水生栖息地，包括氮肥、牲畜粪便、大气沉积物及污水，使水生栖息地中亚硝酸盐水平升高，降低水生呼吸物种的血液携氧能力，从而导致鱼类健康受损和大量死亡[2]。在加工肉制品方面，亚硝酸盐是一种广泛使用的添加剂，可抑制一些致病微生物和不良微生物(如肉毒梭菌)的生长，同时使肉制品呈现典型的粉红色，并具有独特的风味。然而，亚硝酸盐的使用会导致肉制品中形成致癌物亚硝胺，它还与胃癌、食道癌、鼻咽癌和膀胱癌的风险增加有关。Zhang等[3]研究了2000—2011年我国11320个肉制品样本中亚硝酸盐状态的变化，85%的样本含有亚硝酸盐，每年约有20%的样本亚硝酸盐含量高于国家标准；结果还表明，肉制品中残留的亚硝酸盐总体上没有得到有效控制，在2000—2011年，食品生产和加工过程中过量使用亚硝酸盐的潜在问题及其对健康的影响没有改变，这间接表明亚硝酸盐中毒的可能性和严重的环境污染问题。

目前降解亚硝酸盐的主要方法有物理法、化学法和微生物降解法等，其中微生物降解法具有更高效、健康、环保等优势[4]。而传统筛选目的菌株的一般步骤主要为：(1)从自然环境中采集富含目标菌株的样本；(2)用特定的培养基富集目标菌株；(3)分离纯化；(4)确定分离菌株的性能；(5)通过测序分析确定最有希望的菌株。这个过程耗时，效率低下，而且多仅限于含有目标菌株的环境样本。同时，即使得到目标菌株，后续提取DNA进行测序等步骤也繁杂、耗时，甚至有时鉴定结果不是自己想要的菌种。因此，需要一种新的筛选策略来提高筛选、鉴定的效率。随着时代的发展和科技的进步，DNA和RNA测序技术彻底改变了基因组学领域，高通量测序(HTS)是一项广泛使用并可获得的技术，它允许科学家以及时和经济有效的方式对整个转录组或基因组进行测序，同时，HTS技术已被证明在鉴定和分离一系列以生物技术为目的的有效菌株方面起着至关重要的作用[5-7]。

根据研究，关于降解亚硝酸盐的菌株大多数是乳酸杆菌，如郭志华等[8]从泡菜中筛选出6株，忻晓庭等[9]从发酵蔬菜中筛选出72株，肖秋颖等[10]从发酵牦牛乳中筛选出195株。可见乳酸菌是降解亚硝酸盐的主要菌群，但贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)[11]、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[12]、木糖氧化无色杆菌(A.xylosoxidansstrain)[13]等菌株对亚硝酸盐降解也有良好的效果。同时，优势菌群的筛选，使得其他能降解亚硝酸盐的菌株得不到充分挖掘和利用。随着低成本、高通量测序服务飞速发展，其在微生物菌群筛选及多样性分析中的应用也越来越广泛。本研究通过使用16S高通量测序技术，希望能筛选出一株除乳酸菌之外能高效降解亚硝酸盐的菌株，以期为发掘降解亚硝酸盐菌群资源及其应用价值开发利用提供一定理论基础。

1 实验材料和方法

1.1 实验菌种

菌群FXH1：既能降解亚硝酸盐又能降解硝酸盐的菌株18个；

菌群BFXH2：能降解亚硝酸盐但不能降解硝酸盐的菌株12个。

以上菌种暂由本实验室保藏，菌株理化性质(亚硝酸盐降解率、硝酸盐还原能力、作用环境pH值)本实验室已测定完成，数据由本实验室保存。

1.2 实验方法

将FXH1、BFXH2两个菌群样品进行16S高通量测序，测序由北京百迈客生物科技有限公司完成。

1.3 菌株分子生物学鉴定确认

将目的菌株活化后通过SDS结合蛋白酶K法[14]提取样品基因组DNA，用16S rDNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增，扩增产物交由宝生物工程(大连)有限公司测序，菌株基因序列在NCBI数据库中进行比对，确认是否和16S高通量测序结果一致。

2 结果与分析

2.1 16S高通量测序

2.1.1 样本测序数据质量评估

各样品测序数据质量评估[15]结果见表1。经拼接、质控和嵌合体过滤后，样品BFXH2得到62807条序列，有效序列为55257条；样品FXH1得到61900条序列，有效序列为46800条。

表1 样品测序结果统计Table 1 Statistics of sample sequencing results

2.1.2 基于OTU的Venn图分析

通过聚类得到的各样品的OTU个数见图1。

图1 各样品OTU个数分布图Fig.1 OTU number distribution diagram of each sample

由图1可知，样品BFXH2的OTU数为13，样品FXH1的OTU数为20。

在97%的相似度水平下，得到了每个样品的OTU数，再利用Venn图[16]进行分析，可进一步找出不同样品中独立和共有的菌群数目。

图2 OTU-Venn图Fig.2 OTU-Venn diagram

由图2可知，两个样品共有OTU数为9，样品BFXH2有4个特有的OTU数，样品FXH1有11个特有的OTU数。

2.1.3 Alpha多样性分析

Alpha多样性分析可反映单个样品的物种丰度和物种多样性，可用于衡量的指标有Chao1和Ace(衡量物种丰度)、Shannon和Simpson(衡量物种多样性)，但后者受样品群落中物种丰度和物种均匀度的影响。在相同物种丰度的情况下，群落多样性与均匀度呈正相关，当Shannon指数值越大，Simpson指数值越小时，表明样品的物种多样性越高[17]。在97%的相似度水平下，结果分析见表2。

表2 Alpha多样性指数分析Table 2 Alpha diversity index analysis

由表2可知，FXH1的物种丰度大于BFXH2，且物种多样性更高。

2.1.4 物种分类水平分析

2.1.4.1 门等级分类

图3 门等级物种分布图Fig.3 Species distribution diagram at phylum level

由图3可知，在门等级上，BFXH2包括3个门，其中厚壁菌门所占相对丰度为56.4%，变形菌门占42.6%，放线菌门占0.9%。FXH1包括3个门，其中变形菌门所占相对丰度为70.9%，厚壁菌门占28.1%，放线菌门占1%。

2.1.4.2 属等级分类

图4 属等级物种分布Fig.4 Species distribution diagram at genus level

由图4可知，在属等级上，BFXH2包括8个属，其中芽孢杆菌属所占相对丰度为56.4%，假单胞菌属占10.3%，不动杆菌属占9.6%，克雷伯菌属占4%，泛菌属占0.06%，谷氨酸杆菌属占0.9%，其他占0.6%，未分类占18.1%。FXH1包括10个属，其中乳球菌属所占相对丰度为27.9%，假单胞菌属占26.9%，假交替单胞菌属占21.9%，泛菌属占2.0%，不动杆菌属占1.1%，红球菌属占1.0%，寡养单胞菌属占0.6%，克雷伯菌属占0.4%，其他占0.8%，未分类占17.5%。

2.1.5 16S功能基因预测分析

2.1.5.1 KEGG功能预测分析

图5 BFXH2与FXH1样品KEGG功能预测对比图Fig.5 Comparison of KEGG function prediction of BFXH2 and FXH1 samples

由图5可知，由KEGG功能预测对比可看出两个样品在代谢、遗传信息处理和环境信息处理的丰度方面有较多的显著性差异。其中样品FXH1在代谢功能中的外源生物的生物降解和代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、全面和该书图谱等和在细胞过程功能中的细胞运动、细胞生长和死亡、运输和分解代谢等以及在遗传信息处理功能中的转录、复制和修复、翻译上相对丰度显著大于样品BFXH2；而样品BFXH2在碳水化合物代谢、能量代谢、辅助因子和维生素的代谢和在环境信息处理功能中的信号转导、膜转运上相对丰度显著大于样品FXH1。

2.1.5.2 COG功能预测

由图6可知，由COG功能预测对比可看出两个样品在细胞过程与传递、信息存储与处理和代谢等方面的丰度有较多的显著性差异。其中样品FXH1在细胞过程与信号传递功能中的信号转导机制、细胞壁/膜/包膜生物发生、细胞内运输、分泌和囊泡运输、细胞运动性等和在代谢功能中的核苷酸转运和代谢、脂类的运输和代谢等以及在信息存储与处理功能中的翻译、核糖体结构和生物发生、复制、重组和修复、RNA加工和修饰上相对丰度显著大于样品BFXH2；样品BFXH2在代谢功能中的能源生产和转换、氨基酸的运输和代谢、碳水化合物的运输和代谢、次生代谢产物的生物合成、运输和分解代谢和在信息存储与处理功能中的转录以及在细胞过程与信号传递功能中的细胞外结构、防御机制上相对丰度显著大于样品FXH1。

2.2 菌株分子生物学鉴定确认

因样品BFXH2中芽孢杆菌属所占丰度较大，且芽孢杆菌属应用前景良好，因此从中选出菌株“8”进行分子生物学鉴定。对菌株“8”进行NCBI的16S rDNA 基因序列比对分析，初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)，结果显示与16S高通量测序结果对应。

图6 BFXH2与FXH1样品COG功能预测对比图Fig.6 Comparison of COG function prediction of BFXH2 and FXH1 samples

3 讨论与结论

高通量测序技术因测序数量庞大、涵盖面广、检测快速准确等优点，已被广泛应用，如在发酵食品微生物多样性的研究[18]、泡菜中常见食源性致病菌风险分析[19]及对酸浆水中的微生物组成情况分析[20]等方面。而本文通过高通量测序技术对能降解亚硝酸盐的FXH1、BFXH2两个样品进行物种丰度、物种多样性、不同分类水平分析，并进一步进行了功能基因的预测。最后根据微生物组成与结构分析，在属等级上，BFXH2中芽孢杆菌属所占丰度最大，为56.4%，从中挑选编号为“8”的菌株进行鉴定，经鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)，此菌对亚硝酸盐的降解率为99.7%，作用环境pH为3.98。根据研究发现芽孢杆菌应用广泛，如可用在酱腌菜中，降低泡菜中亚硝酸盐和生物胺等有害物质[21]，作为淡豆豉炮制过程中对黄曲霉毒素的抑制菌[22]，在酱香大曲中作为产酱香菌[23]等方面，同时Hong等[24]的研究结果表明可将B.subtilis和B.indicus菌株用作食品补充剂，由此可预见菌株“8”具有良好的应用潜能，特别是在降解亚硝酸盐方面可发挥很大的作用。该种筛选策略不仅可以大大提高对菌种资源的利用，降低筛选成本和时间，大大提高选菌及鉴定的效率，同时还可进一步了解其应用前景，为相应菌株的进一步应用提供一定的借鉴。