人脐带间充质干细胞外泌体保护人视网膜色素上皮细胞抵抗高糖诱导的细胞凋亡

嵇芳芳 金吉 梁亚

糖尿病作为一种损害机体多器官及组织的慢性内分泌疾病，属于全球性问题。目前我国的糖尿病患者数量位列全球首位，且发病率逐年提升[1]。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞是眼球部一种独特的上皮细胞，其能够直接转运葡萄糖分子为视网膜神经感觉层细胞提供能量，RPE细胞作为视网膜的外屏障，因此极易受到血糖水平波动的影响，进而发生病理和功能的改变[2]。长期处于高糖环境下的糖尿病患者，机体高浓度糖刺激容易诱导RPE细胞因产生过多氧自由基而造成氧化应激损伤，RPE 细胞功能会出现紊乱受损，造成视网膜神经感觉层能量供给障碍进而导致多种视网膜病变[3]。糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)作为最常见的 I 和II型糖尿病微血管严重的并发症，是由血糖增高导致的视网膜血管通透性增加导致患者出现糖尿病黄斑水肿(diabetic macularedema,DME)，是视力丧失的最常见病因。目前糖尿病性视网膜病变已经成为全球成年人的主要致盲性眼部疾病，严重影响眼盲患者的日常生活[4]。尽管大量研究探索了DR的病因学及病理学，但是对DR治疗方案仍有待进步，需要进一步研究创新性药物和治疗靶标，以期改善DR患者预后。

人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells，hUMSCs)是具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，能够分泌各种生长因子在免疫抑制，炎症调节和组织损伤修复中起重要作用。已有研究尝试将hUMSCs应用于针对DR的治疗中[5]。外泌体是由多种活细胞分泌到细胞外直径约30～100 nm的小囊泡，具有双层脂质膜性结构，可以携带蛋白、核酸及脂质等生物活性分子作用到靶细胞调控各种生理功能。有研究证明来源于hUMSCs的外泌体在生物表型上与来源细胞一致保持，并且可以作为细胞间运载体将所携带的核酸及蛋白质等生物活性物质带到受体细胞/靶细胞中发挥调控作用，影响受体细胞/靶细胞的生理生化反应，显示出具有治疗多种疾病的潜在能力[6]。值得特别注意的是，在移植hUMSCs入人体内后往往会发生不良分化，尤其是具有可能导致机体局部成瘤的风险，而移植时采用hUMSCs来源的外泌体则可以大大降低这种不良分化以及成瘤的风险。因此，hUMSCs来源外泌体在疾病治疗方面比hUMSCs细胞治疗风险更小，应用治疗范围更广[7]。本实验中，通过观察hUMSCs来源的外泌体对高糖作用下的RPE细胞的抗凋亡功能及分子机制方面进行探讨。

资料与方法

一、实验材料

实验研究。hUMSCs购自上海中乔新舟生物科技有限公司，人RPE细胞(ARPE-19)购自美国ATCC公司；干细胞培养基、Dulbecco Eagle 高糖培养基、胎牛血清购自上海培元公司，去外泌体胎牛血清(Exo-FBS )购自SBI公司(美国)；相关一抗均购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶( HRP ) 标记抗兔、抗鼠二抗购自美国CST公司。PVDF硝酸纤维素膜 (美国 Millipore)，DAPI (美国life)，蛋白酶、磷酸酶抑制剂(Takara)，ECL增强化学发光试剂盒 (南京诺唯赞生物技术有限公司)，CCK8检测试剂 (上海碧云天生物技术有限公司)，低温超速离心机(美国Beckman公司)。

二、蛋白提取及蛋白质免疫印记(Western blot)

收集细胞，冷PBS 洗两遍后离心细胞沉淀，去上清加入适量的RIPA裂解液 (使用前加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂)，放置于冰上反应10～20 min，期间斡旋震荡10～15 s以完成细胞裂解。12000 g，4 ℃离心10 min，取适量上清移至新的离心管；用 BCA 蛋白浓度测定法检测上清蛋白浓度，将6X上样缓冲液和上清适量混合均匀，95 ℃加热5 min后进行SDS电泳分离；当溴酚蓝泳至胶板底部附近时停止，取下凝胶进行转膜(电压100 V 50 min)，结束后轻轻取出 PVDF 膜用2%BSA封闭1 h后进行一抗孵育过夜(4 ℃)。PVDF 膜用PBST清洗3次后孵育HRP连接二抗稀释液1 h，最后用ECL检测液显影。

三、外泌体提取分离

收集hUMSCs的培养上清液，进行一系列梯度离心去除细胞碎片(300 g，5 min；2000 g，20 min)；去除大囊泡(12000 g离心40 min)。把上清液通过0.22 μm的过滤器(Millipore)，100000 g 4 ℃超速离心3 h(L-80XP超速离心机)。用PBS重悬沉淀，再次在100000 g超速离心3 h(4 ℃)，将沉淀颗粒重新悬浮在PBS中用于后续实验。

四、透射电镜(TEM)

将外泌体用2.5%的戊二醛在0.1M的缓冲液中重新悬浮，并在室温下固定在碳涂层的铜网格上30 min，然后用2%的铀酰盐负染1～2 min，用清水洗一次室温晾干。使用透射电子显微镜(JEM-2100)获取图像。

五、纳米颗粒追踪分析检测(NTA)

使用纳米颗粒跟踪分析仪器(ZetaView，德国)对外泌体的数量和尺寸大小进行检测。简言之：将溶液中的外泌体用PBS稀释后上机检测，根据稀释系数确定其相对浓度。用NTA 2.2软件进行数据分析。每个样品进行至少4个单独的计数，并对计数进行平均。

六、细胞增殖检测(CCK-8)

将ARPE-19细胞接种在96孔板贴壁24 h后，根据实验设置分别进行5.6 mmol/L、30 mmol/L、30 mmol/L+外泌体处理后，分别孵育24 h、48 h和72 h后按照操作说明在每孔中加入10 μl的CCK-8试剂，将96孔板放回37 ℃培养箱中孵育4 h后，用酶标仪在450 nm处进行测定，后根据公式计算细胞的活力。

七、EdU试验、流式细胞术检测细胞增殖

取状态良好的ARPE-19细胞，以不同浓度葡萄糖培养，分组分别为：5.6 mmol/L处理组，30 mmol/L处理组，30 mmol/L+外泌体处理组；每组设置3个重复，24 h后收集细胞，用流式细胞仪检测并分析细胞周期变化；参考锐博EdU试剂盒说明书对细胞进行孵育、固定、通透等处理，染色完成后加PBS缓冲液避光保存，在荧光显微镜下观察。

八、统计学分析方法

结 果

一、 hUMSCs外泌体的分离及鉴定

培养hUMSCs并收集其上清进行差速离心去除hUMSCs的碎片及细胞外大囊泡后，利用超速离心分离得到细胞外泌体。透射电镜下可见hUMSCs来源外泌体为直径在30～100 nm之间圆形或椭圆形具有明显膜结构的小囊泡，囊泡腔内可见低电子密度成分(图1A)，纳米颗粒追踪分析(NTA)也证实了提取的hUMSCs外泌体形态和粒径大小符合外泌体特征(图.1B)。另外，运用蛋白质免疫印记( Westernblot )检测发现：间充质干细胞外泌体表达外泌体特异蛋白Alix、CD63及CD9，提示超速离心法能够获得纯度较高的hUMSCs外泌体。

图1 A：提取分离hUMSCs外泌体，固定负染后进行电镜成像 (比例尺：100 nm) B：NTA检测hUMSCs外泌体数量和尺寸大小分布 C：hUMSCs外泌体进行western bolt鉴定外泌体标志蛋白Alix, CD63,CD9 图2 A：对贴壁ARPE-19细胞进行5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌体分别处理0 h、24 h、48 h和72 h后，用CCK 8试剂盒检测细胞在450 nm处吸光值，每个处理至少进行3次生物学重复取平均值 B：贴壁ARPE-19细胞进行5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌体处理48 h后加入稀释好的EdU试剂，PBS清洗3次后固定，DAPI染细胞核，荧光显微镜下获取细胞图片(比例尺：200 μm) C：对5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌体处理的ARPE-19细胞提取蛋白，用western bolt检测细胞周期蛋白E和D1

二、hUMSCs外泌体对高糖培养下ARPE-19细胞的增殖影响。

首先，通过CCK-8实验检测不同糖浓度(5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌体)处理相应时间后，发现高糖培养显著抑制RPE细胞的增殖，而高糖+外泌体处理组细胞增殖能力恢复到正常水平，外泌体的添加缓解了高糖培养诱导的ARPE-19细胞损伤(图2A)。同时，EdU实验表明高糖造成的增殖抑制同样能被间充质干细胞外泌体逆转(图2B)。另外，如图2C所示，当细胞增殖被高糖环境抑制时，周期蛋白E、D1显著减少；间充质干细胞外泌体恢复高糖降低的ARPE-19细胞周期蛋白E、D1到正常水平。总结来说，hUMSCs外泌体能够促进ARPE-19细胞的增殖从而降低高糖培养造成的细胞损伤。

三、hUMSCs外泌体对高糖培养下ARPE-19细胞的抗凋亡作用

在高糖培养条件下，我们发现，ARPE-19细胞内的caspase3发生切割，Bcl-2受高糖影响减少，而hUMSCs外泌体能抑制caspase3切割体的产生，阻止Bcl-2的减少，降低了高糖培养诱导的细胞凋亡(图3A)。同样，流式细胞仪检测证明hUMSCs外泌体显著降低高糖诱导的细胞凋亡率(20～30%)(图3B)。表明hUMSCs外泌体能够保护人RPE细胞抵抗高糖诱导的细胞凋亡。

图3 A：提取分别用5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌体处理的ARPE-19细胞蛋白，通过蛋白质免疫印迹检测caspase3/cleaved-caspase3/Bax/Bcl-2蛋白的变化 B：收集5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌体处理48 h的ARPE-19细胞，用流式细胞仪检测细胞凋亡率

讨 论

处于视网膜最外单层的RPE细胞，它不仅可以吸收阳光，提供给视网膜外层营养，还可以维持光感受器的新陈代谢功能，除此之外，还参与视觉循环和细胞因子的分泌。因此,RPE对视网膜光感受器的维持至关重要。一些糖尿病患者由于长期处于高糖环境下，会诱发RPE出现缺血、炎症激活及氧化应激等病理改变,最终导致DR[1，8]。

由于DR的发病率和流行率在全球范围内不断上升，有效的治疗药物研发及其调控机制研究迫在眉睫。间充质干细胞(MSCs)一类具有多方向分化潜能的干细胞，多存在于骨髓和脂肪等多种组织中的。其中，源于人脐带的华通氏胶组织的hUMSCs，制备产量高，其具有抗炎、调节免疫、免疫反应低、容易体外分离和细胞可连续传代培养等优点，是有希望用于治疗各种疾病的一类活细胞工具[7]。但有些研究结果表明，hUMSCs移植后会分化为癌相关成纤维细胞，易增强肿瘤细胞生长和侵袭力，甚至能够促进癌细胞增殖成瘤和迁移，另外还可促血管生成，诱导细胞抗凋亡和耐药性的产生[7][9]。来源于hUMSCs的外泌体不具有其母源细胞特点，还可以降低由于MSCs移植带来的不良分化致瘤等风险，具有开发为治疗疾病的潜力。另外，在体外进行培养MSCs过程中，其外泌体分泌与其他相比量多，易于提取和储存[10，11]。因此本实验选择了优点较多的hUMSCs来提取外泌体。在此研究中，我们首先成功的从hUMSCs细胞培养上清液中提取了外泌体，并经过NTA和电镜检测提取的外泌体形态和体积符合其定义[12]，并通过western blot对外泌体标记物CD63、CD9和Alix进行鉴定，证实外泌体提取成功，其成分可靠。目前认为差异超速离心法是在提取外泌体实验中最常用的方法，具有提取样品容量大，提取成本低等优点。

源于hUMSCs的外泌体包含有蛋白质、脂类、mRNA、microRNA等成分，可将遗传信息传递给受体细胞，从而改变受体细胞内遗传物质的转录和翻译的过程,调整细胞内蛋白质的修饰和定位，调控信号通路等方式来影响细胞的生理生化功能。Xiao Li等[13]将来源于人脐带间充质干细胞的外泌体应用于治疗体内及体外严重烧伤诱导的过度炎症实验研究，揭示了hUMSCs外泌体通过抑制TLR4和NF-κB信号通路从而抑制了炎症应答，缓解了严重烧伤导致的过度炎症。Ruenn等[14]研究结果表明，间充质干细胞来源的外泌体通过利用补充蛋白质来缓解心脏再灌注损伤，缓解缺血性心脏病症。在本实验的功能和机制研究中,我们发现，与正常葡萄糖浓度组(5.6 mmol/L)以及高糖组(30 mmol/L)相比，在高糖损伤环境下，hUMSCs来源的外泌体可显著提高细胞ARPE-19的活性，且能够促进cyclin E和cyclin D1在高糖作用下的表达；同时，这种外泌体可显著降低高糖损伤环境下ARPE-19细胞凋亡率，抑制高糖所诱导的凋亡蛋白如cleaved-caspase3及Bax的产生。我们的结果表明,hUMSCs来源的外泌体在治疗DR方面具备一定的潜在价值,具备成为未来治疗DR的一种新的手段。接下来的工作需要对hUMSCs来源的外泌体所包含的发挥特定效应的分子进行鉴定和研究。