八种藏药材体外抗菌活性评价*

王朔 赵宏济 严达世 王鸿伟 赵思远 杜宝中

（西藏大学医学院，西藏 拉萨 850000）

抗生素自从问世以来就成为了人类对抗疾病的有力武器，近百年来更是成为了现代医学的基石之一，除了被用于治疗一系列感染性疾病外，也经常被当做预防和支持用药，用于器官移植和化疗等现代医疗程序。21世纪，平均预期年龄大幅度的上升与抗生素的发现密切相关，它经常被看做是一种万能药［1］。但随着抗生素越来越广泛的使用，抗生素耐药性的问题也变得日益严重，现在已经成为全世界公共卫生的关注焦点［2］，抗生素的耐药性会带来诸多危害，如医疗成本的增加、住院时间延长，不仅可能导致患者的临床转归变差甚至是死亡风险的增加。据统计，目前全年世界每年至少有70万的患者因为耐药菌的感染而死亡，在2050年前抗生素耐药问题如果得不到有效的改善，因耐药菌感染的死亡人数有可能增加至1000 万［3］。新的耐药菌不断出现使寻找解决细菌耐药性有效方法成为当前临床亟待解决的问题。近年来，相关研究人员陆续开发了一些全新结构和作用机制的抗菌药物用于临床，如新型β-内酰胺酶抑制剂、头孢地尔、吉布达星等，当前看来这些药具有一定的临床应用前景［4］，但是新型抗生素的临床运用会使病原菌出现新的耐药机制，耐药菌也会越来越广泛［5］。2019 年，Ursula Theuretzbacher等对正在进行临床试验以及获批的50 余种（截至2018 年7 月1 日）新开发的抗菌药物进行相关分析后发现［6］，抗菌药物耐药趋势是现有研发抗菌药物难以应对的，故需要寻找其他的有效途径以解决临床耐药菌治疗问题。目前许多学者开始将目光投向具有较小毒副作用、安全性高、来源广泛、价格低廉等优点的传统医药，如中草药、藏药等。经过长期临床实践，许多传统医药常用药材具有良好的抗菌作用，且相对毒副作用较小，作用靶点多，细菌不易对其形成耐药，因此从传统医药常用药材中寻找开发新型抗菌药物解决细菌耐药性问题有着广阔的前景［7］。藏医药是中国民族医药的重要组成部分，位列四大民族医药榜首。西藏地区藏医药材资源丰富、来源广泛，藏医理论体系完善、治疗方式独特，深受人们的肯定与信赖。

本研究评价了8 种藏药材乙醇超声提取物对6 种临床常见病原菌的体外抗菌活性，希望为新型抗菌药物的开发提供一定的实验数据，为细菌感染性疾病的临床治疗提供一定的参考。

1 材料

1.1 实验药材

8 种试验藏药材均为自采于西藏本地，阴干后备用。试验藏药材名称、用药部位及自采地见表1，自采试验药材均由西藏大学医学院药学系“药用植物学”副教授卓玛东智确认。所用药材部分留样保存于西藏大学医学院病原生物学实验室，以备查验。

表1 8种试验藏药材名称、用药部位及产地

1.2 实验菌株

金黄色葡萄球菌（ATCC29213）、粪肠球菌（ATCC 29212）、枯草芽胞杆菌（ATCC6633）、大肠埃希氏菌（ATCC25922）、肺炎克雷伯杆菌（ATCC700603）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）均由西藏大学医学院病原生物学实验室保存。

1.3 培养基与试剂

MH 肉汤培养基购自英国OXOID 公司；营养琼脂培养基购自北京天坛生物公司；按照说明书配制，置于4 ℃冰箱一周内使用。

75%、95%及无水乙醇购自成都化学试剂厂，65%乙醇由无水乙醇自行配制；DMSO 购自天津科密欧试剂有限公司。

1.4 实验器材

电子称（瑞士梅特勒—托利多公司）、B2 生物安全柜（美国Thermo 公司）、Buchi R 300 旋转蒸发仪（瑞士布琦有限公司）、G154DW 高压蒸汽灭菌器（厦门致微公司）、Branson 5800 超声提取仪（美国必能信公司）、HH.B11.420恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）、麦氏浊度仪（法国梅里埃公司）、微量移液器（德国艾本德公司）、96孔平底细胞培养板（美国康宁公司）等。

2 实验方法

2.1 试验药材乙醇提取物制备

将8 种试验药材粉碎，各取50g，分别以500mL 75%、95%、65%乙醇浸泡24h，超声提取30min，四层无菌纱布过滤，合并滤液，旋转蒸发仪40℃减压浓缩至一定体积，将浓缩液转移至无菌平皿中真空冷冻干燥备用。

2.2 试验药物原液制备

电子称称取各提取物0.4g～0.6g，以DMSO 溶解定溶至50mg·mL-1药物原液备用。

2.3 试验菌液的制备

将保存的试验菌株划线接种于营养琼脂培养基平板，37℃过夜培养，再次营养琼脂培养基平板接种复壮，挑取单菌落以无菌生理盐水为稀释液比浊仪比浊制备0.5 麦氏单位菌液，菌液以MH 肉汤培养基1:100稀释，即为试验菌液，15 min内接种使用。

2.4 试验药材乙醇提取物体外抗菌活性测定

本实验采用微量稀释法。操作简述如下：取无菌96 孔平底细胞培养板，分别于每行的1 至11 孔加入MH培养基100μL，然后于每四行的第1孔中加入受试药物100μL，混匀后吸取100μL 转移至第2 孔中，并以此类推进行二倍稀释至第11 孔，混匀后弃掉100μL；每四行的1 至3 行前11 孔加入100μL 试验菌液，第4行1 至11 孔加入100μL MH 培养基作为“无菌生长孔”（阳性对照）。每试验药液的最终浓度为50mg·mL-1、25mg·mL-1、12.5mg·mL-1、6.25mg·mL-1、3.125mg·mL-1、1.563mg·mL-1、0.781mg·mL-1、0.391mg·mL-1、0.195mg·mL-1、0.098mg·mL-1以 及0.049mg·mL-1。A12～D12 加入200μLMH 培养基作为“培养基对照”，E12～H12 分别加入100μLMHB 培养基和试验菌液作为“菌液对照”（阴性对照）。96 孔平底细胞培养板置于灭菌湿盒中，37℃恒温箱培养24h后观察结果。

2.5 结果评定

光线充足条件下与对照孔（阳性对照、阴性对照）比较，检视各实验孔菌株生长情况。96孔平底细胞培养板内MH培养基呈混浊状或有菌膜生长等则判定为有菌生长，反之则判定为无菌生长。其中，无菌生长孔所含最低药物浓度即为试验药物的MIC（最小抑菌浓度）值。

3 结果

8 种藏药材乙醇提取物对3 种革兰氏阴性试验菌株MIC 见表2。8 种藏药材乙醇提取物中川西锦鸡儿对铜绿假单胞菌的MIC 值为6.25 mg·mL-1、昆仑蒿对大肠埃希菌MIC 值为3.125 mg·mL-1，这两个藏药的提取物能体现出对革兰氏阴性试验菌株有一定的抑制活性，其余提取物对三种革兰氏阴性菌抑菌活性不甚理想（MIC≥12.5mg·mL-1）。

表2 8种藏药材乙醇提取物对3种革兰氏阴性菌株的MIC值（mg·mL -1）

8 种藏药材乙醇提取物对3 种革兰氏阳性试验菌株抑菌活性优于三种革兰氏阴性菌株，其中藏沙蒿对粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的MIC 值达0.781mg·mL-1、齿苞黄堇对金黄色葡萄球菌的MIC 值达0.781mg·mL-1、昆仑蒿对粪肠球菌的MIC值达0.391mg·mL-1、川西锦鸡儿对金黄色葡萄球菌的MIC 值达0.781mg·mL-1、藏麻黄提取物对粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的MIC 值分别达0.195mg·mL-1和0.391mg·mL-1，对枯草芽胞杆菌的MIC为3.125 mg·mL-1。8种藏药材乙醇提取物对枯草芽胞杆菌的体外抗菌活性最好的为吉隆风毛菊，MIC值达0.195 mg·mL-1。各提取物对3种所试革兰氏阳性菌的具体MIC见表3。

表3 8种藏药材乙醇提取物对3种革兰氏阳性菌株的MIC值（mg·mL -1）

4 讨论

本研究所试八种藏药材乙醇提取物对六种所试菌株均有不同程度的体外抗菌活性。其中对三种革兰氏阳性试验菌株的体外抗菌活性均优于三种所试革兰氏阴性菌株，此可能与两类试验菌株的结构差异有关。革兰氏阴性菌细胞含有较厚的脂质外膜、细胞膜以及周浆间隙，各种杀菌物质相较于革兰氏阳性菌而言不易进入细胞内发挥作用，故而在多数药用植物抗菌活性研究中对革兰氏阴性菌抗菌活性不如革兰氏阳性菌，本研究结果亦是如此。

三种蒿属植物对三种革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用（除了臭蒿对粪肠球菌的抑制作用不甚理想）。蒿属植物多具有清热解毒、祛风除湿、抗菌消炎等功效，蒿属植物富含黄酮、挥发油等化合物，其抗菌作用多与这些成分有关［8］；齿苞黄堇为紫堇属植物，有研究表明该属植物的抗菌作用主要与其所富含的异喹啉生物碱和多酚化合物有关［9］。锦鸡儿属藏药化学成分主要包括黄酮类、二苯乙烯低聚体类、苯丙素、香豆素、萜类和甾体等类型化合物，所以川西锦鸡儿的抗菌作用可能与这些成分有关［10］；吉隆风毛菊对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制活性比较强，可能和其所含的小极性的挥发油或萜类成分有关［11-12］；二萜类化合物是翠雀属植物的特征性化合物，被公认是有效成分和毒性成分，蓝翠雀花的抑菌作用可能与此类化合物相关［13］；藏麻黄为麻黄科麻黄属藏医常用药材，具有止血、清脾热的功效［14］，其抗菌作用研究尚未见报道。研究显示麻黄主要化学成分包括生物碱类、黄酮类以及挥发油类等［15］，藏麻黄抗菌活性可能与其所含这些成分的作用有关。。

现代药理学研究发现，传统医药所用药材成分复杂，常经多成分作用于多靶点，通过多种代谢途径发挥治疗作用［16］。抗菌活性初步筛选常常是基于药材的体外抑菌试验来进行的，然而，研究显示，许多传统医药药材不仅对病原菌具有直接抗菌活性，也可通过增强机体免疫力、降低病原菌的毒力等发挥体内抗菌活性，比如，淫羊藿多糖对T 细胞的增殖和分化有直接强化作用［17-18］；猪岑、党参和黄芪可以提高外周血淋巴细胞的转化率和鸡淋巴细胞花环（ERFC）的形成率［19］。本研究结果显示，藏麻黄提取物对粪肠球菌以及吉隆风毛菊对枯草芽胞杆菌具有较强的体外的抗菌效果（两者MIC=0.195mg·mL-1），具有进一步深入研究其具体抗菌活性成分、作用机制以及评价其体内抗菌活性的潜力。