磷肥施用深度对苜蓿根颈抗氧化酶活性及抗寒性的影响

夏全超，张玉霞,b，孙明雪，陈卫东，杜晓艳，张庆昕，张冬梅

(内蒙古民族大学a农学院，b生态环境与绿色发展研究院，内蒙古 通辽 028000)

苜蓿(MedicagosativaL.)作为世界上栽培时间最悠久的豆科牧草[1]，具有营养价值高，适口性好，能改善土壤肥力等优点，国家把苜蓿产业化作为突破口带动了草业和农业的发展，因此苜蓿产业化发展在整个草业系统工程中占据着极其重要的地位[2]。科尔沁沙地位于农牧交错带，依托于自然条件的优势和国家政策的扶持，近年来科尔沁地区已成为我国苜蓿种植产业化水平较高的新兴苜蓿生产区[3]。但是科尔沁沙地降水主要集中在夏季，冬季干旱少雪，并且近年来经常出现极端低温、倒春寒等现象，严重限制了苜蓿越冬[4-5]。磷素是植物体内能调控其生长发育的重要元素之一，既是植物体内重要化合物的组成元素又参与调控多种关键的酶促反应及代谢途径[6]。有研究表明，施用磷肥能显著提高苜蓿抗氧化酶活性，保护植物细胞膜，清除活性氧，提高苜蓿抗寒性[7-8]。但是磷肥施入土壤后，由于被土壤中表面反应、化学沉淀和生物吸收机制等固持，磷肥在土壤中的移动性差，无法全部被植物吸收和利用，而且磷肥施用深度多集中在距离土壤表面0～10 cm处，导致表面富足、下层不足的现象[9-10]，但是过量施用磷肥又会导致土壤表面板结，既造成浪费，又污染环境[11]。目前，关于磷肥施用下移深度对其他作物生长及生理特性方面的研究很多，但关于磷肥施用下移深度对苜蓿抗寒生理特性影响方面的研究甚少。因此，本研究分析了不同磷肥施用深度处理下苜蓿根颈生理指标(MDA、SOD、POD、CAT)的变化特点及其与苜蓿抗寒性的关系，旨在为科尔沁沙地苜蓿抗寒高产栽培中磷肥的高效管理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于内蒙古通辽市开鲁县东风镇林辉草业公司基地(43°60′N，121°31′E)，该地区属于温带大陆性半干旱气候，四季分明，夏季炎热多雨，冬季干旱少雪，≥10 ℃年积温3 000～3 200 ℃，年平均气温5.8 ℃，无霜期140～150 d，年平均降水量约370 mm，年平均风速3.1～4.3 m/s；土壤有机质含量64.10 mg/kg，碱解氮含量35.88 mg/kg，全氮含量44.01 mg/kg，速效磷含量3.59 mg/kg，速效钾含量77.89 mg/kg。

1.2 试验设计

1.2.1 大田试验设计 供试材料为‘北极熊’紫花苜蓿品种(M.sativa‘Gibraltar’)，由北京百斯特有限公司提供。试验采用随机区组设计，于2020年7月1日播种，播种量为22.5 kg/hm2，行距为20 cm，小区面积为3 m×5 m=15 m2。磷肥(P2O5)用量为225 kg/hm2，共设置5个施磷深度：施土地表面(S0)和距离地表7.5 cm (S1)、15 cm(S2)、22.5 cm (S3)、30 cm (S4)，并设置不施磷肥作为对照(CK)，每个处理设置3次重复，共18个小区，于播种前一次性施入，施磷方式为开沟条施。播种前一次性施入氯化钾(K2O)150 kg/hm2，施于地表。试验田灌水使用指针式喷灌，并正常进行田间管理。于封冻前期(11月13日)挖取长势一致的苜蓿(越冬器官)，带回室内进行低温胁迫处理，测定抗氧化酶活性和MDA含量。

1.2.2 低温处理 参照朱爱民等[12]的试验方法，每个小区挖取80株长势均匀一致的苜蓿根颈，平均分成4份，其中1份放入4 ℃冰箱中低温冷藏处理，另外3份苜蓿根系用蒸馏水冲洗干净，整齐地排放在20 cm×30 cm的脱脂纯棉布上包裹好后，用3 mL蒸馏水均匀喷洒，使棉布保持湿润，最后用30 cm×30 cm的锡箔纸包裹好，放入可程式恒温恒湿试验箱分别进行-10，-20，-30 ℃低温冷冻处理。可程式恒温恒湿试验箱设置为：以4 ℃为起点，先以4 ℃/h 的速率降温，在目标温度下保持6 h，然后以4 ℃/h的速度升温至4 ℃，取出后在4 ℃下放置12 h，与4 ℃冷藏处理材料同时测定根颈抗氧化酶活性和MDA含量。

1.3 测定指标及方法

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[13]测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法[13]测定，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法[13]测定，过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法[13]测定。

1.4 数据处理

试验数据采用WPS 2019软件整理数据和绘制图表，用DPS 7.0软件进行方差显著性分析及相关性分析，采用Duncan’s新复极差法进行多重比较,分析处理间差异。

2 结果与分析

2.1 施磷深度和低温胁迫处理对苜蓿根颈MDA含量的影响

施磷深度和低温胁迫处理对苜蓿根颈MDA含量的影响见表1。如表1所示，在同一低温胁迫处理下，不同施磷深度下苜蓿根颈的MDA含量均明显小于CK，说明施用磷肥有利于降低苜蓿根颈中的MDA含量，其中S2处理的MDA含量最低，在4，-10，-20，-30 ℃下分别较CK显著降低了50.00%，48.94%，48.61%和50.92%(P<0.05)，说明施磷深度15 cm(S2)最有利于减缓细胞膜受害程度，保护细胞膜结构。在同一施磷深度下，-10 ℃低温胁迫处理的苜蓿根颈MDA含量显著低于其他低温胁迫处理(P<0.05)(S2处理4 ℃除外)；-30 ℃处理苜蓿根颈MDA含量最高，且显著高于其他低温胁迫处理(P<0.05)，说明-30 ℃低温胁迫处理下苜蓿根颈细胞膜脂过氧化反应剧烈，细胞膜损坏严重。

表1 施磷深度和低温胁迫处理对苜蓿根颈MDA含量的影响

2.2 施磷深度和低温胁迫处理对苜蓿根颈SOD活性的影响

施磷深度和低温胁迫处理对苜蓿根颈SOD活性的影响见表2。如表2所示，在同一低温胁迫处理下，不同施磷深度下苜蓿根颈的SOD活性均显著高于CK(―20 ℃下S3、S4处理除外)(P<0.05)，说明施用磷肥有利于提高苜蓿根颈中的SOD活性;且其中S2处理的SOD活性最大，4，-10，-20，-30 ℃低温胁迫处理分别较CK增大了35.61%，31.83%，26.42%和26.59%，说明施磷深度为15 cm(S2)最有利于提高苜蓿根颈的SOD活性。在同一施磷深度下，-10 ℃低温胁迫处理苜蓿根颈SOD活性均显著高于其他低温胁迫处理(P<0.05)，说明-10 ℃处理下苜蓿根颈细胞SOD活性更强，更有利于清除活性氧和自由基；-30 ℃处理苜蓿根颈SOD活性最小，且显著低于其他低温胁迫处理，说明-30 ℃下苜蓿根颈细胞产生的自由基超出SOD清除活性氧能力范围，细胞受到伤害，正常生命活动受到了抑制。

表2 施磷深度和低温胁迫处理对苜蓿根颈SOD活性的影响

2.3 施磷深度和低温胁迫处理对苜蓿根颈POD活性的影响

如表3所示，在同一低温胁迫处理下，不同施磷深度下苜蓿根颈的POD活性均显著高于CK(―20 ℃下S0处理除外)(P<0.05)，说明施用磷肥有利于提高苜蓿根颈中的POD活性，且其中S2处理的POD活性最大，在4，-10，-20，-30 ℃下分别较CK增加了57.46%，53.37%，63.68%和84.67%，说明施磷深度为15 cm(S2)最有利于提高苜蓿根颈的POD活性。在同一施磷深度下，-10 ℃处理的苜蓿根颈POD活性总体上显著高于其他低温胁迫处理(S4处理除外)，说明-10 ℃处理下苜蓿根颈细胞POD活性最强，更有利于降低细胞膜结构的受损程度。

表3 施磷深度和低温胁迫处理对苜蓿根颈POD活性的影响

2.4 施磷深度和低温胁迫处理对苜蓿根颈CAT活性的影响

如表4所示，在同一低温胁迫处理下，不同施磷深度下苜蓿根颈的CAT活性均显著高于CK(-30 ℃下的S4处理除外)(P<0.05)，说明施用磷肥有利于提高苜蓿根颈中的CAT活性;其中S2处理下CAT活性最强，在4，-10，-20，-30 ℃下分别较CK增加了61.58%，53.59%，24.94%和42.16%，说明施磷深度为15 cm(S2)最有利于清除H2O2，保护细胞膜结构。在同一施磷深度下，-10 ℃处理的苜蓿根颈CAT活性均明显高于其他低温胁迫处理，说明-10 ℃低温胁迫处理下苜蓿根颈细胞CAT活性更强，但当温度更低时，活性氧积累程度超过植物CAT的可清除范围，CAT活性反而降低。

表4 施磷深度和低温胁迫处理对苜蓿根颈CAT活性的影响

2.5 苜蓿根颈MDA含量与抗氧化酶活性的相关性分析

如表5所示，在4，-10，-20和-30 ℃低温胁迫处理下，苜蓿根颈的CAT、POD和SOD活性均与MDA含量呈显著或者极显著负相关。在4，-10和-30 ℃处理下，苜蓿根颈SOD活性与CAT、POD活性均呈显著或者极显著正相关。在-10，-20和-30 ℃处理下，苜蓿根颈POD活性与CAT活性呈显著或者极显著正相关。以上结果说明，苜蓿根颈抗氧化酶活性之间为相互协作关系，并且抗氧化酶活性越强，苜蓿根颈的MDA含量越低，膜质过氧化程度减弱，苜蓿越冬能力增强。

表5 不同低温胁迫处理下苜蓿根颈中MDA含量与抗氧化酶活性的相关性

3 讨 论

MDA是一种能与细胞体内各种化学成分发生反应的高活性物质，还能与脂类、糖类和蛋白质等物质交联，继而影响细胞膜结构和细胞的生理机能[14-15]；MDA含量的变化可以反映植物的受伤害程度，当植物受到低温胁迫时，就会积累大量的MDA[16]。本研究结果表明，在同一施磷深度下，随着温度的降低，苜蓿根颈MDA含量呈先降低后升高的趋势，且在-10 ℃处理下达到最小值，这是因为-10 ℃处理刺激植物细胞抗氧化酶活性增强，进而加快了对自由基的消除过程，膜脂过氧化程度得到缓解，MDA含量降低[17]。胡华群[18]研究表明，缺磷时辣椒根系MDA含量增加，施磷能降低辣椒根系的MDA含量；秦宁[19]的研究结果表明，施磷可有效降低桔梗根系MDA含量。本研究结果表明，施用磷肥后，苜蓿根颈中MDA含量明显低于CK，且S2处理苜蓿根颈的MDA含量最小，说明距离土壤表面15 cm(S2)处施用磷肥最有利于降低苜蓿根颈的MDA含量，缓解细胞膜质过氧化程度，减少有害过氧化产物的生成。

4 结 论

同一施磷深度下，随着胁迫温度的降低，苜蓿根颈MDA含量呈先降低后升高的趋势，且在-10 ℃下达到最小值；苜蓿根颈SOD、POD、CAT活性呈先升高后降低的趋势，且在-10 ℃下活性最强；在S2处理下，苜蓿根颈SOD、POD、CAT活性最强，MDA含量最低。因此，建议在科尔沁沙地建植苜蓿时，在距离土壤表面15 cm处施用磷肥，有利于促进苜蓿抗氧化酶活性增强，提高苜蓿抗寒性。