不同根颈直径苜蓿生理生化特性对低温胁迫的响应

朱爱民， 黄卫丽， 韩国栋*， 张玉霞， 王显国， 武 倩

(1. 内蒙古农业大学草原与资源环境学院， 草地资源教育部重点实验室， 农业部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室， 内蒙古自治区草地管理与利用重点实验室， 内蒙古 呼和浩特 010010； 2. 内蒙古自治区林业科学研究院， 内蒙古 呼和浩特 010010；3. 内蒙古民族大学农学院， 内蒙古 通辽 028041； 4. 中国农业大学动物科技学院， 北京 100083)

低温不仅影响苜蓿(MedicagosativaL.)的地理分布，而且影响苜蓿人工草地的可持续利用。国内外学者对苜蓿抗寒性研究较多[1-4]，研究表明，苜蓿的抗寒性与其根系保护酶(超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶)活性强弱有关[5-9]。寇建村等[10]、朱爱民等[11]研究表明，低温锻炼期苜蓿会通过增强根颈中抗氧化酶活性以抵御冻害。除苜蓿根颈中抗氧化酶活性与苜蓿抗寒性密切相关外，苜蓿根颈中非结构碳氮也被认为是抗寒保护物质[12-14]。Krasnak等[15]研究表明，低温胁迫会引起苜蓿根内的可溶性蛋白含量明显升高，认为可溶性蛋白含量的增加有利于苜蓿根系抵御低温胁迫，这与Trunova等[16]、Wldngm等[17]的研究结果相同。除了植物体中可溶性蛋白、可溶性糖外[18]，游离脯氨酸也是一种重要的渗透调节物质，在植物处于不利环境条件时(干旱、寒冷、高温等)，其对维持细胞原生质与环境的渗透平衡具有重要作用[19]。在一定低温胁迫范围内，苜蓿能通过自身调节抵御低温胁迫，但是苜蓿在不同低温胁迫下发生怎样的生理生化反应是需要进一步研究的问题。

苜蓿能否安全越冬不仅取决于自身抗寒能力的强弱，还受环境因素及种植管理水平的影响，适时早播对于提高苜蓿的抗寒性具有重要作用。早播苜蓿可以充分的利用光和热，能保证苜蓿正常的生长发育，根系生长粗壮更有利于其越冬。Schwab等[20]发现根颈越粗，苜蓿耐寒性越强。然而，对于根颈直径对苜蓿抗寒性的贡献率以及苜蓿抗寒生理生化变化机制尚不清楚，因此，本研究在实验室中对不同根颈直径苜蓿根系低温胁迫处理，分析了低温胁迫对不同颈粗苜蓿根颈生理生化指标的影响，以期探明不同根颈直径苜蓿抗寒性的生理生化机制，这将对指导北方寒冷地区苜蓿的高效生产具有重要指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验区自然概况

试验地位于内蒙古自治区赤峰市阿鲁科尔沁旗牧草生产基地，地理位置为42°30′50″ N，115°27′34″ E。试验地土壤营养成分见表1。

表1 试验地土壤养分含量Table 1 Soil nutrient content of the test site

1.2 供试材料

试验材料是由吉林省农业科学院草地研究所提供的‘公农1号’紫花苜蓿品种(MedicagosativaL. ‘Gongnong No.1’)。

1.3 试验设计

大田试验设计：于2017年7月1日采用机械条播的方式进行播种，苜蓿播种量为22.5 kg·hm-2。2017年11月10日土壤冻融期对苜蓿根系取样，挖取苜蓿根系的深度约为20 cm。在实验室中用游标卡尺对紫花苜蓿根颈0.5 cm处进行测量，将苜蓿分成根颈直径大小分别为3.50 mm,5.25 mm,7.00 mm的3个类别，并于4℃恒温冰箱低温保存。

低温处理试验设计：将备用的3种直径大小(3.50 mm,5.25 mm,7.00 mm)苜蓿越冬器官用蒸馏水冲洗干净。共12个处理(3个苜蓿根颈直径、4个低温处理温度)，每个处理3个重复，每个重复10株苜蓿根系，根系长度均控制为15 cm。将根系并排整齐地摆放在厚度为3 mm，长、宽为30 cm×20 cm的脱脂棉上，包裹好后分别均匀喷洒20 mL蒸馏水，最后用长、宽为30 cm×30 cm的锡箔纸包好。放在4℃恒温冰箱中的苜蓿材料作为对照，其他处理放入低温程控箱中进行低温处理，处理目标温度分别为-10℃，-15℃和-20℃。低温程控箱设置为：以4℃为起点，先以4℃·h-1的速率降温，到达设定温度后保持6 h，之后以4℃·h-1的速率升温达到室温后取出置于4℃下保持12 h，然后进行相关指标的测定[21-22]。

1.4 测定项目及方法

用刀片对低温处理后的苜蓿根颈0～0.5 cm处取样，并切片，进行根颈活力、非结构碳氮和抗氧化酶活性的测定。根系活力测定用TTC染色法测定[23]。其他生理生化指标采用邹琦[24]和郝再彬[25]的测定方法：可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法测定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定；淀粉含量采用蒽酮比色法测定；游离氨基酸含量采用茚三酮染色法测定；超氧化物歧化酶(SOD)采用氮蓝四唑法测定；过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法测定；过氧化物酶(POD)采用愈创木酚法测定。

公式中C指苜蓿根颈中的可溶性糖和淀粉含量，N指根颈中的游离氨基酸和可溶性蛋白含量。

1.5 数据分析

使用Microsoft excel软件对数据进行计算，并制作表格。采用SPSS17.0软件对根颈活性、抗氧化酶活性和非结构碳氮等指标做双因素(温度和根颈直径)方差显著性分析，并对不同低温处理下不同颈粗苜蓿根颈生理生化指标与根颈活力做相关性分析。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对不同根颈直径苜蓿生理生化特性的影响

2.1.1温度、根颈直径及交互作用对苜蓿根颈生理生化指标的影响 由表2可知，不同根颈直径的苜蓿在低温胁迫下其生理生化指标变化明显，其中根颈直径对苜蓿根颈活力及根颈中SOD活性有显著影响(P<0.05)，对根颈中可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白及C/N具有极显著影响(P<0.01)。除SOD和POD外，低温胁迫对苜蓿根颈活力、根颈中非结构碳氮、C/N及CAT活性均有极显著影响(P<0.01)。温度和根颈直径的交互作用对苜蓿根颈活力、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和非结构碳氮比具有显著影响(P<0.05)，对淀粉含量有极显著影响(P<0.01)。

表2 温度、根颈直径及交互作用对苜蓿根颈生理生化指标的影响Table 2 Effects of low temperature,root collar diameter and interaction on physiological and biochemical indexes of alfalfa root collar

2.2 低温处理对不同根颈直径苜蓿根颈活力的影响

由表3可知，随低温胁迫强度的加剧不同根颈直径的苜蓿根颈活力均呈逐渐降低的变化趋势。4℃和-10℃处理下的苜蓿根茎活力差异不显著，但均显著大于-15℃和-20℃处理(P<0.05)。其中3.5 cm颈粗的苜蓿在-15℃胁迫下，比-10℃胁迫根颈活力下降了78.1%，下降幅度较大，而5.25 cm和7 cm颈粗的苜蓿在-10℃至-15℃胁迫下根颈活力下降幅度分别为52.2%,35.0%。4℃和-20℃处理下3.5 cm颈粗的苜蓿根颈活力显著大于7 cm颈粗的苜蓿(P<0.05)，在-10℃处理下不同颈粗苜蓿根颈活力差异不显著，-20℃处理下3.5 cm和5.25 cm颈粗苜蓿的根颈活力显著大于7 cm颈粗的苜蓿(P<0.05)。

表3 低温处理对不同根颈直径苜蓿根颈活力的影响Table 3 Effect of low temperature treatment on root collar activity of alfalfa with different root collar diameters 单位：μg·g-1·h-1

2.3 低温处理对不同根颈直径苜蓿根颈非结构碳氮含量及C/N的影响

由表4可知，随低温胁迫强度的加剧不同颈粗的苜蓿根颈中可溶性糖含量均呈增加-降低-增加的变化趋势，先在-10℃处理下达到一个峰值，后在-15℃处理下降低，在-20℃处理下又显著增加。除-20℃外，其他低温处理下3.5 cm和7 cm颈粗的苜蓿根颈中的可溶性糖含量均大于5.25 cm颈粗的苜蓿，且在-10℃下差异达到显著水平(P<0.05)。

表4 低温处理对不同根颈直径苜蓿根颈非结构碳氮含量及C/N的影响Table 4 Effects of low temperature treatment on the content of non-structural carbon and nitrogen and C/N ratio of alfalfa with different collar diameters

随低温胁迫强度的加剧不同颈粗的苜蓿根颈中淀粉含量均呈先增加后降低的变化趋势，其中3.5 cm和5.25 cm颈粗的苜蓿在-15℃下根颈中的淀粉含量达到最高，而7 cm颈粗的苜蓿在-10℃下达到最大。-10℃和-15℃处理下3.5 cm和5.25 cm颈粗的苜蓿根颈中淀粉含量均显著大于4℃和-20℃处理，-10℃处理下7 cm颈粗的苜蓿根颈中淀粉含量显著大于4℃,-15℃和-20℃。4℃和-10℃处理下3.5 cm和7 cm颈粗苜蓿根颈淀粉含量显著大于5.25 cm颈粗的苜蓿，而-15℃处理下3.5 cm和5.25 cm颈粗的苜蓿根颈淀粉含量显著大于7 cm颈粗的苜蓿。

随低温胁迫强度的加剧不同颈粗苜蓿根颈中游离氨基酸的含量均呈先降低后增加的变化趋势，3.5 cm颈粗的苜蓿在-15℃处理下最低，而5.25 cm和7 cm颈粗的苜蓿在-10℃下最低。-10℃和-15℃处理下3.5 cm颈粗的苜蓿根颈中游离氨基酸含量显著大于7 cm颈粗的苜蓿，但与5.25 cm颈粗的苜蓿相比差异不显著。

不同颈粗苜蓿根颈中的可溶性蛋白含量变化与可溶性糖含量变化趋势一致，随低温胁迫强度的加剧呈增加-降低-增加的变化。苜蓿根颈中可溶性蛋白含量均在-15℃下达到最低，显著低于4℃和-10℃处理。4℃和-10℃处理下5.25 cm和7 cm颈粗苜蓿根颈中可溶性蛋白含量显著大于3.5 cm颈粗的苜蓿。

随低温胁迫强度的加剧不同颈粗苜蓿根颈中的C/N均呈先增加后降低的变化趋势，C/N均在-15℃下达到最大。-15℃处理下3.5 cm颈粗的苜蓿根颈中C/N显著大于4℃和-20℃，5.25 cm和7 cm颈粗的苜蓿根颈中的C/N在-15℃和-20℃处理显著大于4℃，-10℃处理。4℃和-10℃处理下3.5 cm颈粗的苜蓿根颈中C/N显著大于5.25 cm和7 cm颈粗的苜蓿。

2.4 低温处理对不同根颈直径苜蓿根颈抗氧化酶活性的影响

由表5可知，随低温胁迫强度的加剧，3.5 cm颈粗的苜蓿根颈中SOD活性呈先增加后降低的变化，在-15℃处理下达到最大，5.25 cm颈粗的苜蓿呈逐渐增加的变化，在-20℃处理下最大，7 cm颈粗的苜蓿在4℃,-15℃处理下较高，显著大于-20℃处理(P<0.05)。随苜蓿根颈直径的增加，4℃处理下苜蓿根颈中SOD活性逐渐增加，-10℃和-15℃处理下根颈中SOD活性逐渐降低，-20℃处理下根颈中SOD活性呈先增加后降低变化。

表5 低温处理对不同根颈直径苜蓿根颈抗氧化酶活性的影响Table 5 The effect of low temperature treatment on antioxidant enzyme activity of alfalfa root collar with different diameters

4℃和-20℃处理下3.5 cm颈粗的苜蓿根颈中POD活性显著大于-10℃处理(P<0.05)。4℃处理下3.5 cm颈粗的苜蓿根颈POD活性显著大于7 cm颈粗的苜蓿(P<0.05)，但与5.25 cm颈粗的苜蓿相比差异不显著。-10℃处理下5.25 cm和7 cm颈粗的苜蓿根颈POD活性显著大于3.25 cm颈粗的苜蓿(P<0.05)。

随低温胁迫强度的加剧不同颈粗苜蓿根颈中CAT活性均呈先增加后降低的变化趋势，3.5 cm和5.25 cm颈粗的苜蓿根颈CAT活性在-10℃处理下最高，而7 cm颈粗的活性则在-15℃下达到最大。-15℃处理下7 cm颈粗的苜蓿根颈中CAT活性显著大于3.5 cm颈粗的苜蓿(P<0.05)，-20℃处理下3.5 cm和5.25 cm颈粗的苜蓿根颈中CAT活性显著大于7 cm颈粗的苜蓿(P<0.05)。

2.5 根颈直径、温度和根颈活力与非结构碳氮及抗氧化酶活性的相关性分析

相关性分析表明(表6)，苜蓿根颈直径大小与根颈中的可溶性蛋白含量呈显著的正相关关系。温度高低与苜蓿根颈中可溶性糖含量呈显著的负相关关系，与可溶性蛋白含量呈显著的正相关关系，与根颈中C/N比呈极显著的负相关关系。

表6 根颈直径、温度与非结构碳氮含量、C/N及抗氧化酶活性的相关性分析Table 6 Correlation analysis of C/N ratio,non-structural carbon,nitrogen and antioxidant enzyme activity with temperature and root collar diameter

由表7可知，苜蓿根颈活力与根颈中可溶性糖含量呈显著的负相关关系，与可溶性蛋白含量呈极显著的正相关关系，与CAT活性呈显著的正相关关系，与根颈中C/N呈极显著的负相关关系。

表7 苜蓿根颈活力与根颈中非结构碳氮及抗氧化酶活性的相关性分析Table 7 Correlation analysis of alfalfa root collar activity with non-structural carbon,nitrogen and antioxidant enzyme activities in root collar

3 讨论

根颈活力是判断植物抗寒性大小的重要指标[27-28]，研究表明[22]，低温胁迫后苜蓿植株根颈活力会明显下降，通过测定苜蓿根颈活力的大小可以判断苜蓿抗寒性的强弱。本研究表明，苜蓿根颈活力对低温的响应极其敏感，根颈直径较小的苜蓿耐受低温的能力小，说明根颈直径小的苜蓿抗寒性较弱，根颈直径较大的苜蓿抗寒性较强。

前人的研究表明[16-17]，苜蓿根颈中可溶性糖、可溶性蛋白及游离氨基酸含量的升高有利于苜蓿抗寒性的增强。本研究中，根颈直径和低温胁迫对苜蓿根颈中可溶性糖和可溶性蛋白含量均有显著影响，但两个因素交互作用影响却未达到显著水平。说明根颈直径较粗的苜蓿可能会通过调节根颈中可溶性糖和可溶性蛋白含量的降低以消除低温胁迫的影响。C/N间接反映植物组织中非结构碳氮物质含量，是衡量植物抗逆性的重要指标，研究表明植物根系C/N越高对植物越冬越有利[29]。本研究发现不同颈粗的苜蓿根颈中可溶性糖和可溶性蛋白含量随温度的降低变化趋势一致，但游离氨基酸含量变化趋势则不同，说明不同颈粗苜蓿在低温胁迫下调节根颈中非结构碳氮含量的能力不同。研究表明[22,30]，苜蓿耐受低温胁迫的能力是有限的，即一定温度的低温胁迫条件下苜蓿能通过自身的生理生化调节以适应低温环境，当温度超过苜蓿耐受低温胁迫的极限时，苜蓿根系将会受到冻伤或冻害。本研究中不同颈粗苜蓿根颈中CAT活性与非结构碳氮比变化趋势一致，均呈先增加后降低的变化趋势，但不同颈粗的苜蓿根颈中CAT活性最强处的胁迫温度不同。说明根颈中CAT参与了苜蓿抵御低温胁迫的自身调节过程，且不同颈粗苜蓿耐低温和调控能力不同[9,11]。

相关性分析和双因素方差分析均表明苜蓿根颈可溶性蛋白含量与苜蓿根颈大小密切相关，温度和根颈活力与可溶性糖、可溶性蛋白、CAT活性和C/N关系密切，说明不同根颈直径的苜蓿在受到低温胁迫时通过调控根颈中可溶性蛋白、可溶性糖、CAT活性和C/N以适应或抵御低温胁迫[11,26,31]。结合根颈活力值的变化及不同颈粗苜蓿根颈中生理生化指标变化的拐点温度，研究认为，当在目标温度低温胁迫处理6 h时，3.5 cm颈粗的苜蓿耐受低温的极限温度在-10℃至-15℃之间，而5.25 cm和7 cm颈粗的苜蓿耐受低温的极限在-15℃至-20℃之间。在一定低温胁迫范围内，苜蓿通过增加根颈中CAT活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量及调节根颈中的非结构碳氮比以抵御低温胁迫，但当低温胁迫温度超过苜蓿的耐受极限时则苜蓿根颈中CAT活性会迅速降低逐渐失活，而可溶性蛋白和可溶性糖含量则会先降低后迅速增加，这可能与根颈中可溶性糖和可溶性蛋白进一步水解有关[32]，仍需进一步的研究加以佐证。

4 结论

苜蓿通过调控根颈中可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、过氧化氢酶活性和非结构碳氮比以适应或抵御低温胁迫，根颈直径小的苜蓿调控能力较弱，根颈直径较大的苜蓿调控能力较大。当在目标温度低温胁迫处理6 h时，3.5 cm颈粗的苜蓿耐受低温的极限温度在-10℃至-15℃之间，而5.25 cm和7 cm颈粗的苜蓿耐受低温的极限在-15℃至-20℃之间。