基于TGF－β1/Smad3信号通路探讨黄芪甲苷对甲状腺功能减退幼鼠肾损伤的改善作用

张晖，刘鹏，常毅娜，李晓乐

（1.河南科技大学第一附属医院，河南 洛阳 471000；2.郑州大学第三附属医院，河南 郑州 450000）

甲状腺功能减退症（hypothyroidism，HT）是由于甲状腺无法正常产生满足机体需要的甲状腺激素（thyroid hormone，THs）所引起的一种内分泌系统疾病［1-2］，其中未经治疗的HT 婴儿和新生儿有永久性智力低下风险，超过3 岁的儿童在HT 发作时也可能发生轻微认知障碍，身材矮小和骨龄延迟为HT 常见的两种表现，严重影响患者的生活质量［3］。THs 影响肾脏发育、肾脏血流动力学、肾小球滤过率以及钠和水的稳态［4］，HT 患者常伴有肾功能损伤，但关于HT 肾功能不全的机制尚不完全清楚，研究发现，HT 与肾脏纤维化的进展相关［5］，因此探讨HT 与肾纤维化损伤所致的肾功能不全表现对于HT 并发症的预防及治疗具有重要意义。转化生长因子－β（transforming growth factor－β1，TGF－β）是一种通过上调细胞外基质（extracellular matrix，ECM）表达和促进肾纤维化而导致肾损伤的有效致病因子，大量研究表明，TGF－β1/Smad3 通路失调是组织纤维化的重要致病机制［6］。黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ，AS－Ⅳ）是从中药黄芪中提取的天然三萜糖苷，具有抗炎、抗氧化和抗纤维化等多种药理活性［7］，研究发现其可抑制TGF－β1 诱导的肾纤维化［8］，但关于AS－Ⅳ是否可通过TGF－β1/Smad3 信号通路改善HT 幼鼠肾损伤的报道较少。6－丙基－2－硫尿嘧啶（6－propyl－2－thiouracil，PTU）是一种用于治疗甲状腺功能亢进的药物，也被广泛应用于诱导啮齿动物甲状腺功能减退的实验中［1］，故本研究拟利用PTU 构建HT 幼鼠模型，并以HT 经典治疗药物左甲状腺素钠（levothyroxine sodium，LS）为阳性对照，探讨AS－Ⅳ对HT 幼鼠肾损伤的改善作用及可能作用机制，以期为HT 伴随的肾功能不全机制提供一定的理论依据及参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

30日龄SPF 级Wistar 大鼠60 只，雌雄均可，体质量（70±10）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，生产许可号：SCXK（湘）2019－001。

1.1.2 药品、主要试剂和仪器

AS－Ⅳ（纯度＞98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；PTU（纯度≥99%，美国Sigma公司）；LS（国药准字H20010522，25 μg，深圳市中联制药有限公司）；考马斯亮蓝G250（北京索莱宝科技有限公司）；Masson染色试剂盒（北京雷根生物技术有限公司）；游离三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）、游离甲状腺素（free thyroxine，FT4）及促甲状腺素（thyrotropin，TSH）ELISA检测试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）；兔抗TGFβ1、Smad3、p－Smad3、Smad7、α－平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，α－SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ，Col Ⅰ）多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；兔抗TGF－β受体Ⅰ型（TGF－β Receptor type Ⅰ，TβRI）多克隆抗体（SCBT公司）；全自动生化分析仪（中山新锐医疗设备科技有限公司）；多功能酶标仪（南京德铁生物科技有限公司）；Bio－Rad凝胶成像系统（美国伯乐公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模、分组及给药

恒温（22 ± 2）℃、恒湿环境下普通饲养，12 h 光照/12 h 黑暗交替，适应1 周后，随机选择10 只幼鼠作为正常组，剩余50 只参考文献［9］用于构建HT 幼鼠模型。连续28 d 灌胃6 mg/kg 剂量的PTU 后通过股动脉采血，评估血清中的FT3、FT4 及TSH 水平以确认大鼠甲状腺功能状态，当FT3 ≤（107.2 ± 0.8）ng/mL，FT4 ≤（1.7±0.6）ng/mL 且TSH ≥（19.60±3.08）mIU/L时即为甲状腺功能减退［10］。经评估，成功构建HT 幼鼠模型共43 只，随机剔除3 只后，剩余40 只随机分为模型组、AS－Ⅳ低剂量组、AS－Ⅳ高剂量组及LS 组，每组各10 只。AS－Ⅳ低、高剂量组大鼠均灌胃AS－Ⅳ，给药剂量分别为20、40 mg/（kg·d）；LS 组灌胃LS，给药剂量为5 μg/（kg·d），正常组及模型组大鼠每日灌胃等体积生理盐水，连续干预5 周。干预期间为保证甲状腺功能处于减退状态，继续灌胃6 mg/kg 剂量的PTU，1 次/2 d。

1.2.2 标本采集与处理

末次给药后，将幼鼠分别置于单独的代谢笼中收集24 h 尿液样本，以检测24 h 尿白蛋白（albumin，Alb）含量。再将各组幼鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，称重，心脏取血，3 000 r/min，4 ℃离心15 min，取血清－80 ℃保存，用于ELISA 及生化检测；脱颈处死，取左肾组织，称重后保存于4%多聚甲醛中固定，用于HE 及Masson 染色；取右肾组织称重，切碎后保存于液氮中，用于Western blot检测。

1.2.3 ELISA法检测FT3、FT4及TSH水平

设置标准品孔、样本孔及空白孔，根据说明书配制所需试剂，分别将样品（5 倍稀释）及标准品液加入相应检测孔内，抗体包被温育，洗板，加入酶结合物工作液，洗板，加入显色工作液后终止液终止反应，450 nm 波长处测定各孔OD 值，以标准品浓度作横坐标，对应OD 值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各组幼鼠血清中FT3、FT4 及TSH水平。

1.2.4 肾脏脏器系数测定

采用肾脏脏器系数评估肾脏损伤情况，计算公式如下：

肾脏脏器系数（%）= 全肾重（g）/体质量（g）×100%

1.2.5 Bradford法测定大鼠24 h尿Alb含量

于96 孔板标准孔内加入不同浓度标准品，于待测样本孔内加入稀释10倍的尿液样本，均加入200 μL考马斯亮蓝G250 染色液，缓慢吹打混匀，室温静置反应5 min 后，去除气泡，于570 nm 波长处测定各孔吸光度值，绘制标准曲线并计算尿液样本24 h尿Alb含量。

1.2.6 HE染色法观察肾组织形态学变化

肾组织经4%多聚甲醛固定过夜，常规石蜡包埋并制备为4 μm切片，二甲苯、梯度乙醇及蒸馏水脱蜡，苏木精染液染核5 min，盐酸乙醇分化10 s，氨水返蓝，伊红染液染色2 min，脱水，透明，中性树胶封片，镜下观察并采集图片。

1.2.7 Masson染色法观察肾组织胶原蛋白沉积情况

切片常规脱蜡，Weigert 铁苏木素染色4 min，酸性乙醇分化20 s，Masson 蓝化液返蓝，丽春红品红染液染色5 min，弱酸溶液洗涤，磷钼酸溶液洗涤2 min，弱酸工作液洗涤，苯胺蓝溶液浸泡1 min，弱酸溶液洗涤，脱水，透明，中性树胶封片，镜下观察并采集图片。肾区胶原染色呈蓝色，用于评估肾纤维化。

1.2.8 Western blot 法检测TGF－β1/Smad3 信号通路相关因子蛋白表达情况

取液氮中肾组织，碾碎后移至裂解液中匀浆裂解，12 000g（离心半径24 cm）低温离心10 min，取上清。测定全蛋白浓度并统一加热变性蛋白，SDS－PAGE 凝胶电泳（压缩胶60 V，25 min，分离胶120 V，60 min）分散蛋白条带，转膜（湿转200 mA，120 min）后将PVDF膜于5%脱脂奶粉中封闭2 h；一抗（α－SMA 以1∶500稀释，其他抗体均以1：1 000 稀释）内4 ℃孵育过夜；次日洗膜，换液3 次，每次15 min，二抗（1∶8 000 稀释）孵育2 h，洗膜并换液3次，每次15 min，ECL显影，利用化学发光凝胶成像系统曝光并拍照记录。采用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白TGF－β1、TβRI、Smad3、Smad7、α－SMA 及Col Ⅰ与内参GAPDH 灰度值比值表示蛋白的相对表达量，以p－Smad3/Smad3 评估蛋白活化水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件分析数据并进行统计学处理，计量结果以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间比较采用LSD－t检验。以P ＜0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组幼鼠血清FT3、FT4及TSH水平比较

ELISA 结果显示，5 组幼鼠血清FT3、FT4 及TSH 水平差异具有统计学意义（P＜0.001）。进一步两两比较结果显示，与正常组比较，其他4 组幼鼠血清FT3、FT4水平均降低，TSH 水平均升高（P＜0.05）；与模型组比较，AS－Ⅳ低、高剂量组及LS组幼鼠血清FT3、FT4水平升高，TSH 水平降低（P＜0.05）；与AS－Ⅳ低剂量组比较，AS－Ⅳ高剂量组及LS 组幼鼠血清FT3、FT4 水平升高，TSH水平降低（P＜0.05）；与AS－Ⅳ高剂量组比较，LS 组幼鼠血清FT3、FT4 水平升高，TSH 水平降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组幼鼠血清FT3、FT4及TSH水平比较（±s，n=10）

表1 各组幼鼠血清FT3、FT4及TSH水平比较（±s，n=10）

注：与正常组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与AS－Ⅳ低剂量组比较，cP ＜0.05；与AS－Ⅳ高剂量组比较，dP ＜0.05。

组别正常组模型组AS－Ⅳ低剂量组AS－Ⅳ高剂量组LS组F值P值FT3（ng/mL）118.89±6.54 47.81±3.63a 60.26±4.18ab 86.01±5.80abc 107.09±6.63abcd 300.279＜0.001 FT4（ng/mL）3.15±0.36 0.71±0.10a 0.99±0.12ab 1.57±0.11abc 2.39±0.27abcd 212.368＜0.001 TSH（mIU/L）5.69±0.44 27.76±3.36a 23.24±2.36ab 16.26±1.16abc 9.47±1.07abcd 216.537＜0.001

2.2 各组幼鼠肾脏脏器系数比较

计量结果显示，5组幼鼠肾脏脏器系数差异具有统计学意义（P＜0.001）。进一步两两比较结果显示，与正常组比较，其他4 组幼鼠肾脏脏器系数均升高（P＜0.05）；与模型组比较，AS－Ⅳ低、高剂量组及LS组幼鼠肾脏脏器系数降低（P＜0.05）；与AS－Ⅳ低剂量组比较，AS－Ⅳ高剂量组及LS 组幼鼠肾脏脏器系数降低（P＜0.05）；与AS－Ⅳ高剂量组比较，LS组幼鼠肾脏脏器系数降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组幼鼠肾脏脏器系数结果比较（±s，%）

表2 各组幼鼠肾脏脏器系数结果比较（±s，%）

注：与正常组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与AS－Ⅳ低剂量组比较，cP ＜0.05；与AS－Ⅳ高剂量组比较，dP ＜0.05。

组别正常组模型组AS－Ⅳ低剂量组AS－Ⅳ高剂量组LS组F值P值n 10 10 10 10 10肾脏脏器系数0.55±0.03 1.38±0.15a 1.09±0.12ab 0.89±0.09abc 0.68±0.06abcd 110.071＜0.001

2.3 各组幼鼠24 h尿Alb含量比较

Bradford 法检测结果显示，5 组幼鼠24 h 尿Alb 含量差异具有统计学意义（P＜0.001）。进一步两两比较结果显示，与正常组比较，其他4组幼鼠24 h尿Alb含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，AS－Ⅳ低、高剂量组及LS组幼鼠24 h尿Alb含量降低（P＜0.05）；与AS－Ⅳ低剂量组比较，AS－Ⅳ高剂量组及LS组幼鼠24 h尿Alb含量降低（P＜0.05）；与AS－Ⅳ高剂量组比较，LS组幼鼠24 h尿Alb含量降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组幼鼠24 h尿Alb含量比较（±s，mg/24 h）

表3 各组幼鼠24 h尿Alb含量比较（±s，mg/24 h）

注：与正常组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与AS－Ⅳ低剂量组比较，cP ＜0.05；与AS－Ⅳ高剂量组比较，dP ＜0.05。

组别正常组模型组AS－Ⅳ低剂量组AS－Ⅳ高剂量组LS组F值P值n 10 10 10 10 10 24 h尿Alb 13.23±1.51 31.88±3.81a 26.66±2.41ab 19.28±1.64abc 17.27±1.48abcd 102.536＜0.001

2.4 各组幼鼠血清肌酐（Serum creatinine，Scr）及尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）含量比较

生化检测结果显示，5组幼鼠血清Scr及BUN 含量差异具有统计学意义（P＜0.001）。进一步两两比较结果显示，与正常组比较，模型组幼鼠血清Scr 及BUN含量均升高（P＜0.05）；与模型组比较，AS－Ⅳ低、高剂量组及LS 组幼鼠血清Scr 及BUN 含量降低（P＜0.05）；与AS－Ⅳ低剂量组比较，AS－Ⅳ高剂量组及LS 组幼鼠血清Scr 及BUN 含量降低（P＜0.05）；与AS－Ⅳ高剂量组比较，LS 组幼鼠血清Scr 及BUN 含量（P＜0.05）。见表4。

表4 各组幼鼠血清Scr、BUN含量比较（±s）

表4 各组幼鼠血清Scr、BUN含量比较（±s）

注：与正常组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与AS－Ⅳ低剂量组比较，cP ＜0.05；与AS－Ⅳ高剂量组比较，dP ＜0.05。

组别正常组模型组AS－Ⅳ低剂量组AS－Ⅳ高剂量组LS组F值P值n 10 10 10 10 10 Scr（μmol/L）23.35±2.44 65.85±4.68a 57.79±3.48b 42.07±2.84bc 31.18±3.45bcd 263.220＜0.001 BUN（mmol/L）6.34±0.35 25.14±2.15a 19.47±1.49b 13.79±1.14bc 9.49±0.95bcd 312.939＜0.001

2.5 各组幼鼠肾组织形态学变化比较

HE 染色结果显示，正常组幼鼠肾小球形状规则、结构完整，肾小管上皮细胞排列整齐；模型组幼鼠可见有明显肾间质损伤，系膜基质增多，基底细胞增生，管腔狭窄，炎性细胞严重浸润；AS－Ⅳ低、高剂量组及LS 组幼鼠肾组织损伤逐渐有所改善。见图1。

图1 肾组织HE染色结果（×400）

2.6 各组幼鼠肾组织纤维化情况比较

Masson 染色结果显示，正常组幼鼠肾组织结构清晰，胶原纤维表达极少，主要分布于系膜和肾间质中；模型组幼鼠肾小球系膜区和肾间质区见有大量胶原纤维表达和沉积，组织纤维化病理改变明显；与模型组比较，AS－Ⅳ低、高剂量组及LS 组幼鼠胶原纤维沉积情况逐渐减轻，肾纤维化逐渐改善。见图2。

图2 肾组织Masson染色结果（×400）

2.7 各组幼鼠肾组织中TGF－β1/Smad3 信号通路相关因子蛋白相对表达情况比较

Western blot 结果显示，除Smad3 蛋白相对表达水平无统计学意义（P＞0.05）；5 组幼鼠肾组织中TGFβ1、TβRI、Smad7、α－SMA、Col Ⅰ蛋白相对表达水平及p－Smad3/Smad3差异具有统计学意义（P＜0.001）。进一步两两比较结果显示，与正常组比较，模型组幼鼠肾组织中TGF－β1、TβRI、α－SMA、Col Ⅰ蛋白相对表达水平及p－Smad3/Smad3 蛋白活性水平升高，Smad7蛋白相对表达水平下降（P＜0.05）；与模型组比较，AS－Ⅳ低、高剂量组及LS 组幼鼠肾组织中TGF－β1、TβRI、α－SMA、Col Ⅰ蛋白相对表达水平及p－Smad3/Smad3 蛋白活性水平下降，Smad7 蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）；与AS－Ⅳ低剂量组比较，AS－Ⅳ高剂量组及LS 组幼鼠肾组织中TGF-β1、TβRI、α－SMA、Col Ⅰ蛋白相对表达水平及p－Smad3/Smad3 蛋白活性水平下降，Smad7 蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）；与AS－Ⅳ高剂量组比较，LS 组幼鼠肾组织中TGF－β1、TβRI、α－SMA、Col Ⅰ蛋白相对表达水平及p－Smad3/Smad3 蛋白活性水平下降，Smad7 蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）。见图3、表5。

图3 肾组织中相关蛋白Western blot条带图

表5 各组幼鼠肾组织中TGF－β1/Smad信号通路相关蛋白相对表达情况（±s，n=10）

表5 各组幼鼠肾组织中TGF－β1/Smad信号通路相关蛋白相对表达情况（±s，n=10）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与AS-Ⅳ低剂量组比较，cP＜0.05；与AS-Ⅳ高剂量组比较，dP＜0.05。

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3 讨论

尽管甲状腺功能障碍疾病是常见、易于识别和治疗的疾病，但若未确诊或未经及时治疗，可能会导致严重不良性反应［11－12］。THs 对肾脏生长、发育以及维持水和电解质的稳态至关重要，反过来，肾脏同样影响着THs 代谢。一方面，肾损伤见于原发性和自身免疫性HT，另一方面，非自身免疫性HT 在蛋白尿患者中更为常见，进一步表明HT 与肾损伤之间存在密切联系［13］。

研究发现，垂体衍生的TSH 增加至一定水平与HT 相关，健康甲状腺可合成并分泌T4 和活性更强的T3，因此TSH、FT3 及FT4 水平高低可提示HT 的发生与否［14］。本研究结果显示，与正常组比较，模型组大鼠血清FT3、FT4 水平显著降低，TSH 水平显著升高，提示成功构建HT 幼鼠模型。肾脏脏器系数增大可能与炎症、增生相关，24 h 尿Alb、Scr 及BUN 含量常用于评估肾功能［15］。研究发现，肾纤维化大鼠肾脏脏器系数、24 h 尿Alb、血清Scr 及BUN 含量均见显著增加［16］，本研究结果显示，与正常组比较，模型组幼鼠肾脏脏器系数、24 h 尿Alb、血清Scr 及BUN 含量均显著增加，提示HT 幼鼠存在肾功能损伤；经病理组织学染色观察发现，模型幼鼠肾组织系膜基质增多，基底细胞增生，管腔狭窄，炎性细胞严重浸润，肾小球系膜区和肾间质区见有大量胶原纤维表达和沉积，提示HT 可能导致肾组织结构病理损伤及肾纤维化改变，进而引起肾功能障碍。研究发现，AS－Ⅳ可改善糖尿病小鼠肾小球及肾小管损伤，降低尿白蛋白含量［17］，抑制肾小管间质纤维化［18］，本研究结果显示，AS－Ⅳ低、高剂量组均可降低肾功能损伤生理参数，改善肾组织结构及胶原蛋白沉积情况，提示AS－Ⅳ对于HT 幼鼠所致的肾损伤可发挥一定的改善作用。

纤维化主要表现为肌成纤维细胞活化（如标志物α－SMA高表达）以及以胶原蛋白（如Col Ⅰ）为主的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度沉积［19］。本研究结果显示，模型组幼鼠肾组织中α－SMA、Col Ⅰ蛋白相对表达水平显著升高，而经AS－Ⅳ治疗后，两者表达水平均降低，提示AS－Ⅳ可改善HT 幼鼠肾组织纤维化。TGF－β1 是一种主要的促纤维化因子，在与其受体TβRI 结合后通过激活下游介质包括Smad3 以发挥其生物活性，如ECM 的产生，该过程受Smad7 的负调控［20］。研究发现，驱动TGF－β1/Smad3信号通路可促进肾纤维化发展［21］。另有研究发现，AS－Ⅳ可通过抑制TGF－β1 信号及Smad3 磷酸化，促进Smad7高表达进而抑制二氧化硅诱导的肺成纤维细胞纤维化［22］，本研究结果显示，模型组幼鼠肾组织中TGF－β1、TβRI蛋白相对表达及p－Smad3/Smads水平显著升高，Smad7 蛋白相对表达水平降低，提示HT 幼鼠肾组织中TGF－β1/Smad3 信号通路处于被激活状态，而经AS－Ⅳ治疗后，TGF－β1、TβRI蛋白相对表达及p－Smad3/Smads 水平显著降低，Smad7 蛋白相对表达水平升高，提示AS－Ⅳ可能通过抑制TGF－β1/Smad3信号通路激活进而抑制肾组织纤维化进展并改善肾损伤。

综上所述，AS－Ⅳ可减轻HT 幼鼠肾组织病理结构及肾纤维化改变，改善肾功能，其作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad3信号通路激活有关。