机械振动对股骨头坏死的力学机制研究

张蕾蕾，袁强，范亚楠，王文胜，陈献韬，张颖，刘又文

股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head,ONFH）是骨科领域常见的难治性疾病之一，是造成青壮年残疾的最常见原因[1]。我国成人非创伤性ONFH的发病率为0.725%，且趋于年轻化[2]。据报道激素性股骨头坏死（steroid-induced ONFH,SIONFH）已经成为最常见的非创伤性ONFH 类型，占比高达51%[3]。目前有关SIONFH 的发病机制尚未完全明确[4]，有学者认为糖皮质激素的使用会诱导骨细胞与成骨细胞的凋亡，减缓破骨细胞死亡，延长其寿命，从而吸收骨质来降低骨密度[5]。机械应力是刺激骨组织代谢的重要因素，报道称生理范围内的适宜应力载荷可有效地产生成骨作用，促进骨组织的生长和改建[6]。

本研究旨在通过观察机械振动对大鼠SIONFH模型的骨量、骨微结构、骨强度及力学分子信号的影响，初步探讨其对SIONFH 的力学机制，为进一步阐明临床上应用高能体外冲击波治疗ONFH 提高骨密度、促进骨修复的机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取30 只成年雌雄SD 大鼠（动物来源：河南省动物实验中心；雌20 只，雄10 只；实验动物许可证：SYXK（豫）2015-0001），随机分为空白组、模型组、机械振动组，每组10只。

1.2 大鼠SIONFH的模型制备

参照董玉雷等[7]描述的方法进行造模：将10 只成年雌雄SD大鼠予腹腔注射两次脂多糖（20 μg/kg），每次间隔24 h，24 h后肌内注射超大剂量甲泼尼龙琥珀酸钠（生产厂家：美国辉瑞；生产批次：180716_3）40 mg/kg，连续注射2 周，每次间隔24 h，第3 周开始隔天注射激素1次，5周后处死取材。

1.3 治疗方法

空白组和模型组给予生理盐水（10 ml/kg）灌胃给药，每日1次，连续12 d，末次给药后1 h处死，机械振动组给予每日2 次（0.3 g，3035Hz）机械振动，每次10 min，中间休息5 min，每周5 d。

1.4 Micro-CT 扫描观察各组情况

造模成功筛选后，Micro-CT检测结束后，随机各组挑选3 只进行兴趣区（region of interest,ROI）结构参数对比。包括Tb.Th（骨小梁平均厚度），Tb.Sp（骨小梁之间髓腔平均宽度），Conn.D（每立方毫米体积中骨小梁网状结构之间的连接数量），SMI（描述小梁结构组成结构中板层结构和杆状结构比例的参数。如果结构中骨小梁主要为板层结构，SMI接近于0；反之，如果主要是杆状骨小梁，SMI 接近3），BV/TV（骨组织体积与组织体积比值，可直接反映骨量变化情况），BS/BV（表示单位体积骨组织的面积大小），TB.N（骨小梁数目）。

1.5 ELISA检测血清与成骨密切的相关指标

于大鼠腹主动脉促凝管取血，常温1500 r/min，离心5 min，收集上清，参照ELISA 法检测前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）、环氧化酶2（cyclooxygenase-2,COX-2）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）、骨保护素（osteoprotegerin,OPG）、骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）、核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL）等与成骨密切相关的指标。

1.6 HE染色评估评估ONFH

处死大鼠后，取下股骨等组织，剔除附属组织，4%多聚甲醛固定过夜，10%EDTA 溶液脱钙2 周，常规包埋切片，进行HE染色。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。以均数±标准差表示，各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模情况

模型组造模成功率最高为70%（7/10），机械振动组为50%（5/10）。将造模组和机械振动组各抽取5只造模成功的小鼠进行下一步验证，空白组随机抽取5只进行对照实验（表1）。

表1 大鼠生存及造模成功情况（只）

2.2 Micro-CT观察各组情况

造模成功筛选后，随机各组挑选5只进行ROI结构参数对比，见表2。

表2 各组股骨头ROI结构参数的比较（）

表2 各组股骨头ROI结构参数的比较（）

注：△与空白组比较P＜0.05；▲与空白组比较P＜0.01；○与模型组比较P＜0.05。

2.3 HE染色结果

正常组骨小梁完整，排列规则，脂肪细胞少，骨髓造血干细胞丰富，形态正常。模型组、机械振动组可见不同程度骨小梁稀疏变细，结构紊乱，出现骨髓细胞碎片，骨小梁空骨陷窝或骨小梁内骨细胞核固缩，骨髓细胞坏死，脂肪细胞体积增大。详见图1。

图1 空白组（A）、模型组（B）、机械振动组（C）的HE染色结果

2.4 ELISA检测结果

结果表明，在成骨相关指标检测中，机械振动组的PGE2、COX-2、ALP、OPG、BMP-2、RANKL 与模型组比较差异均有统计学意义（表3）。

表3 ELISA检测血清与成骨密切的相关指标（）

表3 ELISA检测血清与成骨密切的相关指标（）

注：△与空白组比较P＜0.01；▲与模型组比较P＜0.05。

3 讨论

3.1 SIONFH的发生发展机制

目前有关SIONFH 的确切机制尚不清楚，随着分子生物、分子化学、组织细胞等学科的不断发展以及对SIONFH 发病机制的深入研究发现，骨细胞凋亡、细胞自噬、内质网应激等与SIONFH 关系密切[8-10]。有报道称长期服用激素会增高血液凝固性和黏滞度，加重髓内静脉淤滞，增高骨内压，引起骨内循环障碍，降低病变股骨头软骨下骨微血管密度，导致血管通透性异常和血管新生能力变差等[11]。上述病理变化最终加重股骨头缺血[12]，引起骨形成动态平衡体系破坏，进而导致股骨头塌陷，最终导致髋关节残疾。因此，深入了解SIONFH 的发生发展机制对于临床上预防和治疗SIONFH 具有重要的意义。

3.2 力学刺激对SIONFH的影响

力学刺激是骨生长改建的重要调控因素，国内外学者对机械应力下骨的成骨效应进行了大量实验研究[13,14]。分析力学刺激对成骨、破骨或对骨髓干细胞等细胞信号通路的调控和代谢影响的作用机制是目前研究的难点和热点[15]。

刘泽朋等[16]研究发现在SIONFH 的发病过程中，不适当负荷应力与糖皮质激素类药物协同，促进ONFH的发生和发展，不适当应力刺激可通过下调Runx2/Osterix mRNA和上调AJ18mRNA表达抑制成骨细胞的活性，抑制骨形成和骨修复，促进骨吸收。因此临床上针对SIONFH患者，在ONFH早中期阶段应减少病变股骨头的机械应力刺激，以利于骨坏死区新骨形成、骨小梁结构重建，延缓ONFH进程。

本研究结果发现模型组造模成功率高达70%，机械振动组约为50%，说明机械振动可以预防SIONFH的发生。各组的骨组织ROI结构参数中体积、骨组织面积、骨小梁数目等指标与模型组比较差异有统计学意义，表明机械振动可以通过提高骨强度来预防和治疗SIONFH，HE 染色结果也同样证实了这一发现。ELISA检测成骨相关指标检测中，机械振动组的PGE2、COX-2、ALP、OPG、BMP-2、RANKL 与模型组比较差异均有统计学意义，说明机械振动可能通过调控上述靶基因来促进成骨从而防治SIONFH，有待后续进一步研究加以验证。

3.3 对临床工作的启发

体外冲击波治疗是一种新兴的非手术治疗方式，在治疗早期ONFH、骨折延迟愈合及不愈合、膝关节骨髓水肿等疾病方面取得了较好的临床效果[17-19]，实验研究也表明，冲击波在调节骨代谢过程中可诱导骨质疏松性骨质中成骨细胞活性，抑制破骨细胞[20,21]。目前有关体外冲击波治疗ONFH的研究主要集中于临床研究方面，虽然文献报道临床疗效满意，但其具体作用机制确仍不明确。本研究结果表明，机械振动可有效提高SIONFH大鼠的骨强度，且可能通过调控相关靶基因来促进骨形成和骨修复，从而防治SIONFH，从动物实验方面初步阐明了体外冲击波治疗ONFH，提高骨密度，促进骨修复的作用机制。

3.4 本研究的局限性

首先，动物样本量较少，这可能对实验结果造成一定程度的影响；其次，缺少相关的力学及信号通路的实验研究，下一步将继续开展相关工作。

4 结论

机械振动可通过提高骨强度来预防和治疗大鼠SIONFH，且可能通过调控PGE2、COX-2、ALP、OPG、BMP-2、RANKL 等靶基因来促进成骨，为临床中应用体外冲击波治疗ONFH 的有效性和作用机制提供了证据支持，也为下一步深入研究力学及信号通路提供了前期研究基础。

【利益冲突】所有作者均声明不存在利益冲突