血清miR-134及miR-301水平对慢性丙型肝炎肝纤维化的诊断价值

陈永刚 黄刚

陕西中医药大学附属医院1输血科，2检验科（陕西咸阳712000）

慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC）是指由丙型肝炎病毒（HCV）感染所致的以肝脏局部慢性炎性损伤为主的慢性感染性疾病［1-2］，我国为高发国家，且随着社会的发展，CHC 的发病率呈逐年上升趋势［3-4］。研究表明，感染HCV 后，若未得到及时有效的治疗，病情可进一步进展为肝硬化、肝功能衰竭，甚至肝癌，严重威胁患者的生命健康［5］。肝纤维化为CHC 进展为肝硬化的病理过程，因此早期诊断患者肝纤维化程度对诊治CHC及评估预后具有十分重要的临床意义。目前，肝纤维化诊断的金标准为肝脏活体组织穿刺，该式虽具有较高的灵敏度和特异度，但活体组织穿刺具有创伤性，患者疼痛感强烈，这也导致该方法难以动态监测患者病情的变化［6-7］。微小RNA（miRNA）是一类非编码小RNA 分子，主要通过直接靶向结合于特定信使RNA3'端的非编码区进而起到降解该信使RNA 或抑制其蛋白反应的负向调控作用［8-9］。近年来，已有大量研究证实，miRNA 可作为生物标志物用于疾病的诊断及预后评估［10］。既往已有研究证实，miR-134 和miR-301 表达与HCV感染存在密切联系，并在HCV 感染病毒增殖过程中发挥着重要作用，这也为临床上诊断及评估CHC 病情提供新的思路［11-12］。基于此，本研究通过探讨血清miR-134 及miR-301 水平对慢性丙型肝炎肝纤维化的诊断价值，旨在为临床上诊治慢性丙型肝炎肝纤维化提供相关依据。

1 资料与方法

1.1 病例资料 选取2020年2月至2021年2月我院收治的150 例CHC 患者为CHC 组。同期选择150 例体检健康（常规体检项目：血常规、尿常规、肝肾功能、心电图、胸片、血压、血脂、血糖）人群为对照组。所有研究对象及其家属知情且同意。本研究通过医院伦理委员会批准。

1.2 纳入排除标准 CHC 组纳入标准：（1）符合2019年中华医学会肝病分会制定的《丙型肝炎防治指南》相关诊断标准［13］；（2）年龄≥18 岁；（3）完成肝脏活体组织穿刺检查。对照组纳入标准：（1）近1 个月内体检正常者；（2）年龄≥18 岁。排除标准：（1）合并其他病毒性肝炎或感染性疾病者；（2）患有肝脏肿瘤、脂肪肝等其他类型肝脏疾病者；（3）合并其他严重脏器疾病者；（4）近3 个月服用免疫抑制剂等；（5）依从性差者。

1.3 方法 所有研究对象于入组时采用真空干燥管、EDTA-K2 抗凝静脉血各抽血5 mL，分离血清及血浆供后续试验。采用全自动生化分析仪（7600-310，日立）检测研究对象丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）水平。采用RNA 提取试剂盒（TAKARA 公司，日本）提取外周全血RNA，并根据反转录试剂盒进行反转录反应，根据SYBR RT-PCR 试剂盒（中国杭州博日科技有限公司）说明书进行RT-PCR实验。反应体系为：95 ℃预变性30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，循环35 次。采用2-ΔΔCt法来测定各组miR-134 和miR-301 相对表达量，内参为U6，每个样本重复三次，取平均值。引物由中国北京鼎国生物科技有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

CHC 组进行肝组织活体穿刺检查，并对患者肝纤维化程度进行判定［14］：无纤维化，S0；扩大的汇管区纤维化，S1；汇管区周围纤维化，S2；汇管区周围纤维化但小叶结构保留，S3；纤维化并伴有小叶结构紊乱，S4。

1.4 观察指标 （1）比较CHC 组及对照组ALT、AST、TBIL、miR-134 及miR-301 水平；（2）ROC 曲线分析ALT、AST、TBIL、miR-134 及miR-301 水平在诊断显著性肝纤维化（S2-S4 期）中的临床价值；（3）比较不同程度肝纤维化患者ALT、AST、TBIL、miR-134 及miR-301 水平。

1.5 统计学方法 用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。ROC 曲线分析ALT、AST、TBIL、miR-134 及miR-301 水平在诊断显著性肝纤维化（S2-S4 期）中的临床价值。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHC 组及对照组一般资料比较 CHC 组及对照组在年龄、性别等资料上比较差异无统计学意义（P ＞0.05），而在ALT、AST 及TBIL 上比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 CHC 组及对照组一般资料比较Tab.2 Comparison of general information between CHC group and control group ±s

表2 CHC 组及对照组一般资料比较Tab.2 Comparison of general information between CHC group and control group ±s

指标年龄（岁）性别［例（%）］男女ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）CHC 组（n=150）55.2±8.9 81（54.00）69（46.00）122.31±18.95 137.83±20.56 18.72±3.51对照组（n=150）54.7±9.2 84（56.00）66（54.00）25.62±9.93 24.47±6.54 7.51±2.35 t/χ2值0.478 0.121 55.352 64.351 32.503 P 值0.633 0.728＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 CHC 组及对照组miR-134、miR-301 水平比较 相较于对照组，CHC 组miR-134、miR-301 水平更高（P＜0.01），见表3。

表3 CHC 组及对照组miR-134、miR-301 水平比较Tab.3 Comparison of miR-134 and miR-301 levels between CHC group and control group ±s

表3 CHC 组及对照组miR-134、miR-301 水平比较Tab.3 Comparison of miR-134 and miR-301 levels between CHC group and control group ±s

组别CHC 组对照组t 值P 值例数150 150 miR-134 5.89±1.91 2.25±1.07 20.363＜0.001 miR-301 7.60±2.61 2.76±1.34 20.204＜0.001

2.3 CHC 组不同肝纤维化程度患者ALT、AST、TBIL、miR-134、miR-301 水平比较 随着肝纤维化分期的上升，患者ALT、AST、TBIL、miR-134、miR-301 水平也有所上升（P＜0.05），见表4。

表4 CHC 组不同肝纤维化程度患者ALT、AST、TBIL、miR-134、miR-301 水平比较Tab.4 Comparison of ALT、AST、TBIL、miR-134 and miR-301 levels in patients with different liver fibrosis in CHC group ±s

表4 CHC 组不同肝纤维化程度患者ALT、AST、TBIL、miR-134、miR-301 水平比较Tab.4 Comparison of ALT、AST、TBIL、miR-134 and miR-301 levels in patients with different liver fibrosis in CHC group ±s

注：a，与S0 组比较，P ＜0.05；b，与S1 组比较，P ＜0.05；c，与S2 组比较，P ＜0.05；d，与S3 组比较，P ＜0.05

组别S0 S1 S2 S3 S4 F 值P 值例数30 51 24 24 21 miR-134 4.11±0.89 5.14±0.93a 5.97±0.94ab 7.39±0.91abc 8.22±0.36abcd 88.027＜0.001 miR-301 4.24±1.03 5.91±0.96a 7.33±1.24ab 8.87±1.01abc 9.95±0.47abcd 132.352＜0.001 ALT（U/L）116.43±11.24 121.98±10.13a 126.09±8.83ab 133.45±9.21abc 138.13±9.09abcd 19.938＜0.001 AST（U/L）129.44±13.95 134.17±11.08a 140.92±10.56ab 145.21±7.73abc 150.39±7.18abcd 15.768＜0.001 TBIL（μmol/L）13.34±2.25 16.71±2.09a 20.12±1.88ab 23.45±2.31abc 26.67±2.25abcd 74.356＜0.001

2.4 ROC 曲线结果 ROC 曲线结果显示，当miR-134 截断值为4.827 时，其诊断显著性肝纤维化的AUC 为0.825；当miR-301 截断值为9.069 时，其诊断显著性肝纤维化的AUC 为0.775；ALT 截断值为121.51 U/L 时，其诊断显著性肝纤维化的AUC 为0.604；AST 截断值为132.62 U/L 时，其诊断显著性肝纤维化的AUC 为0.573；TBIL 截断值为18.69 μmol/L 时，诊断显著性肝纤维化的AUC 为0.618。见表5 和图1。

图1 miR-134 和miR-301 诊断显著性肝纤维化的ROC 曲线图Fig.1 ROC curve of miR-134 and miR-301 in the diagnosis of significant liver fibrosis

表5 ALT、AST、TBIL、miR-134 和miR-301 诊断显著性肝纤维化的ROC 曲线结果Tab.5 ROC curve results of ALT、AST、TBIL、miR-134 and miR-301 in the diagnosis of significant liver fibrosis

3 讨论

CHC 在发展过程中往往伴有肝细胞慢性坏死以及肝纤维化，对患者生命健康带来严重危害［15］。随着医学技术的发展，无创诊断模型诊断疾病成为医学研究者关注的热点。但多数模型涉及的参数往往为非常规临床检验项目，导致这一类模型难以广泛运用于临床诊断中［16-17］。近年来，已有大量研究证实，miRNA 可参与近1/3 的基因调控，在肝细胞的增殖、分化等过程中起着重要作用［18-19］。此外，miRNA 在血清中性质稳定，检测方式简便，为肝脏相关疾病的诊断、病情评估提供可能。

miR-134 位于人14 号染色体上。既往研究发现，miR-134 及其同簇的miRNA 在肝细胞癌的发生发展中起着关键作用［20］。肝纤维化以及肝癌进展过程中，失调的转录因子肝细胞核因子1a 可对miR-134 进行调控，从而抑制肝脏肿瘤的恶性表型。本研究结果显示，相较于正常人群，CHC 患者miR-134 水平显著上升。笔者进一步发现，随着CHC 患者肝纤维化程度的增加，患者miR-134 水平也有所上升。这提示miR-134 可能参与CHC 的发生发展过程，其水平的变化在一定程度上可反映患者的疾病严重程度，为CHC 疾病的评估提供了相关依据。

miR-301 位于人体第17 号染色体上，既往已有研究证实，miR-301 可参与肿瘤细胞的生长。研究表明，miR-301 在肝细胞癌中呈过表达，并能参与肝癌细胞的增殖、凋亡、迁徙、侵袭等过程，与肝癌的预后密切相关［21］。本研究结果显示，相较于正常人群，CHC 患者miR-301 水平也有所上升。且与miR-134 一致，miR-301 水平随着CHC 患者肝纤维化程度的增加而呈上升趋势，并在一定程度上可反映患者的疾病严重程度。

目前，临床上诊断显著性肝纤维化方式主要为肝活检，该术为有创性，部分患者难以接受，因此探讨安全性更高且有效的生物标志物十分必要。笔者进一步通过ROC 曲线分析了ALT、AST、TBIL、miR-134 及miR-301 在诊断显著性肝纤维化中的临床价值。结果显示，当ALT、AST、TBIL 在诊断显著性肝纤维化中临床价值一般。而miR-134截断值为4.827 时，其诊断显著性肝纤维化的AUC 为0.825，灵敏度为0.934，而特异度为0.871；当miR-301 截断值为9.069 时，其诊断显著性肝纤维化的AUC 为0.775，灵敏度为0.826，特异度为0.922，提示miR-301、miR-134检测可获得较高的诊断价值。

但本研究也存在以下不足：（1）未进一步随访患者预后，难以分析上述指标在评估患者预后中的临床价值；（2）未与其他类型肝炎病毒感染疾病相比较，以分析上述指标的特异性。

综上所述，慢性丙型肝炎患者血清miR-134 及miR-301 水平显著上升，并与患者肝纤维程度密切相关。miR-134 及miR-301 联合检测在诊断显著性肝纤维化中具有一定临床价值。