复合菌制剂和复合酶制剂对柠条锦鸡儿青贮发酵品质和有氧稳定性的影响

李胜楠 张 欢 董臣飞 雷晓青 张桂杰*

(1.宁夏大学农学院动物科学系，银川 750021；2.江苏省农业科学院农业资源与环境研究所，南京 210014；3.云力之星生物科技有限公司，天津 300354)

柠条锦鸡儿(Caraganakorshinskii)是主要分布于我国西北干旱风沙区的豆科灌木，其根系发达、繁殖快、固氮能力强[1]。近年来，宁夏、内蒙等荒漠化地区人工柠条林种植面积持续增长。截至2017年，宁夏盐池县柠条林种植面积为1.73万hm2，而南部山区为76万hm2[2]，这些柠条林不仅在荒漠草原防风固沙与保持水土方面贡献突出，而且成为了当地牲畜一种重要的粗饲料来源。因此，合理开发利用柠条锦鸡儿资源是增加粗饲料供应，发展现代畜牧业的有效途径。

柠条锦鸡儿富含粗蛋白质和异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸等多种必需氨基酸，还含有生物碱、黄酮类、香豆素类等功能性物质，具有较高的饲喂价值[3]。然而，木质素和粗纤维含量随柠条锦鸡儿生育期延长而增加[4]，同时其含有鞣酸和一些挥发性物质，因而适口性差，消化率低[5]。研究表明，平茬能促进柠条锦鸡儿生长，青贮可软化其托刺，发酵后气味酸香，可提高家畜育肥效果[4，6]。与其他优质粗饲料相比，柠条锦鸡儿碳水化合物含量低，纤维素含量和缓冲能高[7]，并且附生的乳酸菌少，单独青贮不易成功。已有研究证实，青贮饲料品质可通过添加纤维素酶和乳酸菌等生物添加剂得到提高[8-10]。纤维素酶和木聚糖酶可协同分解纤维素和木聚糖，同时木聚糖的分解增加了纤维素孔隙度，使其更容易被纤维素酶利用[11]。因而，添加纤维素酶和木聚糖酶青贮发酵有利于降低柠条锦鸡儿纤维素含量。乳酸菌制剂能够增加豆科饲草青贮初期乳酸菌数量，促进乳酸发酵。此外，酵母菌通过调控植物乳酸杆菌代谢产物抑制梭状芽孢杆菌和好氧细菌繁殖，从而减少青贮过程中蛋白质降解[12]。目前，菌制剂和酶制剂联用调控柠条锦鸡儿青贮饲料品质的研究尚不多见，因此，本研究选择青贮专用复合菌制剂和复合酶制剂，探究其对青贮柠条锦鸡儿营养成分、发酵品质和有氧稳定性的影响，为改善柠条锦鸡儿青贮品质提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验样地

柠条锦鸡儿样地位于宁夏自治区吴忠市盐池县十六堡新村，属典型的大陆性季风气候，气候干燥，降水量少而集中，土壤类型主要为灰钙土和风沙土[13]。

1.2 试验材料

试验材料为盛花期宁夏盐池县退耕还林带的人工种植柠条锦鸡儿，其种植年限为5年。刈割后立即机械揉丝粉碎，运回实验室备用。

添加剂：复合菌制剂(酵母菌和植物乳酸杆菌数量分别为1×1011和5×109CFU/g)和复合酶制剂(纤维素酶和木聚糖酶活性分别为2×104和2×103U/g)由天津某生物科技公司提供。柠条锦鸡儿营养成分如表1所示。

表1 柠条锦鸡儿营养成分(干物质基础)

1.3 试验设计

以花期柠条锦鸡儿为青贮原料，试验共设4个组，分别为对照组(CK组)、添加0.05%复合菌制剂组(F组)、添加0.1%复合酶制剂组(X组)和添加0.05%复合菌制剂+0.1%复合酶制剂组(FX组)。

采用Aurora型手持式近红外光谱仪测定柠条锦鸡儿水分含量，调节水分含量至65%左右，将其与添加剂按上述试验设计方案混合。每组3个重复，每个重复称取500 g左右调制好的样品装入聚乙烯袋(20 cm×30 cm)，真空封口机抽真空和密封，置于室内(25 ℃左右)避光保存，贮藏60 d后测定营养成分、发酵特性、微生物数量及有氧稳定性。

1.4 指标测定

1.4.1 原料与青贮饲料化学成分测定

取200 g柠条锦鸡儿原料和青贮饲料，置于105 ℃烘箱中杀青30 min，65 ℃烘干至恒重，测定干物质(dry matter，DM)含量。将烘干样用DJ-10A粉碎机粉碎，过2 mm筛后用于测定营养成分含量。采用凯氏定氮法测定粗蛋白质(crude protein，CP)含量[14]，采用范式洗涤纤维法测定酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)和中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)含量[15]，采用自动脂肪分析仪(XT15i，ANKOM公司，美国)测定粗脂肪(ether extract，EE)含量，采用灼烧恒质量法测定粗灰分(Ash)含量，采用蒽酮-硫酸比色法测定可溶性碳水化合物(water-soluble carbohydrate，WSC)含量[16]。总可消化养分(total digestible nutrient，TDN)计算公式[17]如下：

TDN(%)=88.9-(ADF×0.779)。

1.4.2 青贮发酵品质测定

青贮60 d后，取5 g样品放入含45 mL无菌水的锥形瓶中，振荡使其完全浸入水中，4 ℃下封口保存24 h，用4层纱布过滤获得浸提液，利用雷磁PHS-3G精密pH计测定pH。采用苯酚-次氯酸钠比色法[18]测定氨态氮(NH3-N)含量，以氨态氮/总氮(NH3-N/TN)表示。乳酸(lactic acid，LA)含量使用乳酸测试盒(A019-2-1型，南京建成生物工程研究所)测定[19]。参照许庆方等[20]的方法利用日本岛津LC-16高效液相色谱仪测定乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyric acid，BA)含量。根据《粗饲料品质评价手册》V-Score评分标准和所测青贮饲料中NH3-N、乙酸、丙酸和丁酸含量进行发酵品质评价，总评分为NH3-N、乙酸+丙酸和丁酸3项得分之和，满分100分；将青贮饲料划分为3个等级，分别为良好(>80分)、尚可(60～80分)和不良(<60分)[21]，V-Score评分标准如表2所示。

表2 V-Score评分标准

1.4.3 微生物数量测定

利用稀释平板涂布法对微生物菌落中乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)、酵母菌(yeast)和霉菌(mold)进行计数。乳酸菌采用MRS琼脂培养基，酵母菌和霉菌选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)。将接种好的MRS培养基于37 ℃厌氧生化箱中培养48 h，PDA培养基于28 ℃培养24～36 h后进行计数，用lg(CFU/g)表示计数单位。

1.4.4 有氧稳定性测定

青贮60 d后，立即将青贮饲料混合均匀装入新的青贮袋中，在发酵袋几何中心处插入温度记录仪(HOBO Pendant Temperature/Light，美国)，扎紧封口，在袋子上扎一些小孔通气，置于室温下保存。在室内不同位置放置3个温度记录仪，记录仪每30 min自动记录1次温度，当青贮袋中的温度高于室温2 ℃时停止计时。

1.5 数据处理

采用Excel 2010对数据进行整理，采用SPSS 22.0软件对数据进行单因素方差分析和Duncan氏法多重比较检验，试验结果以平均值±标准误差表示，以P<0.05为差异显著判断。

2 结 果

2.1 添加剂对柠条锦鸡儿青贮营养成分的影响

如表3所示，F、X和FX组青贮饲料WSC含量显著低于CK组(P<0.05)；其中，FX组青贮饲料WSC含量最低，为1.36%。F、X和FX组青贮饲料NDF含量显著低于CK组(P<0.05)；其中，FX组青贮饲料NDF含量最低，为65.31%。X和FX组青贮饲料ADF含量显著低于CK组(P<0.05)，TDN含量显著高于CK组(P<0.05)。各组之间青贮饲料DM、CP、EE和Ash含量无显著差异(P>0.05)。

表3 各组柠条锦鸡儿青贮营养成分(干物质基础)

2.2 添加剂对柠条锦鸡儿青贮发酵特性的影响

如表4所示，F、X和FX组青贮饲料pH、丙酸含量和NH3-N/TN显著低于CK组(P<0.05)，乳酸含量和乳酸/乙酸显著高于CK组(P<0.05)；其中，FX组青贮饲料乳酸含量和乳酸/乙酸最高。X组青贮饲料乙酸含量显著高于其他各组(P<0.05)。各组均未检测到丁酸。

表4 各组柠条锦鸡儿青贮的发酵品质(干物质基础)

依据NH3-N/TN、乙酸、丙酸和丁酸含量测定结果，采用V-Score评分体系对青贮饲料发酵品质进行综合评分，结果如表5所示，CK组青贮饲料总分最低，为89.96；F、X和FX组青贮饲料总分均在90分以上，等级均为良好。

表5 各组V-Score得分

2.3 添加剂对柠条锦鸡儿青贮微生物数量的影响

如表6所示，F、X和FX组青贮饲料乳酸菌数量显著高于CK组(P<0.05)；其中，FX组青贮饲料乳酸菌数量最高，为7.80 lg(CFU/g)。FX组青贮饲料酵母菌数量显著低于其他各组(P<0.05)，F组青贮饲料酵母菌数量显著高于其他各组(P<0.05)。各组之间青贮饲料霉菌数量较少，且无显著差异(P>0.05)。

表6 各组柠条锦鸡儿青贮微生物数量

2.4 添加剂对柠条锦鸡儿青贮有氧稳定性的影响

由图1可知，在有氧暴露后，CK、F、X和FX组青贮饲料有氧变质时间分别为49.00、48.33、55.33和54.33 h。X和FX组青贮饲料有氧稳定性显著高于CK组和F组(P<0.05)。

数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 添加剂对柠条锦鸡儿青贮营养成分的影响

青贮过程中，WSC含量直接关系到青贮调制难易程度，其作为微生物发酵底物，能为微生物增殖提供能量来源。本试验中，F、X和FX组青贮饲料WSC含量显著低于CK组，FX组青贮饲料WSC含量最低。这可能是因为F组中本身富含乳酸菌，为满足生长繁殖而利用了大量WSC，从而降低了青贮饲料中残余的WSC含量。此外，有益微生物利用纤维素酶降解纤维成分所产生的WSC作为碳源，促进了自身生长和繁殖[22]，因而X组中残余的WSC含量较低。FX组WSC含量最低，这可能由于复合菌制剂和复合酶制剂之间存在复杂作用，具体原因需进一步研究。饲草纤维含量对反刍动物的干物质采食量和消化率有重要影响，其中ADF含量与动物饲草消化率呈负相关，ADF含量越低，消化率越高，饲喂价值越大[23]。酶制剂对植物纤维成分的降解作用已被国内外许多研究证明[23-24]。本研究表明，与CK组相比，F组青贮饲料NDF含量显著降低，而ADF含量无显著差异，可能因为柠条锦鸡儿细胞壁成分复杂，且木质素含量较高，并与半纤维素结合成更复杂的结构[25]，致使复合菌附着能力有限。X组青贮饲料NDF和ADF含量低于CK组，表明酶制剂可有效降低柠条锦鸡儿青贮纤维含量，从而提高其适口性。酶制剂可促进柠条锦鸡儿细胞壁纤维成分降解，为乳酸菌生产乳酸提供了额外的底物[5]，同时促进微生物快速利用底物并产生具有溶解纤维活性的微生物酶[26]。FX组青贮饲料NDF和ADF含量低于F和X组，说明同时添加复合菌制剂和复合酶制剂有利于降低柠条锦鸡儿青贮中纤维含量，改善饲草消化率。谢凤莲等[9]研究发现，使用复合菌和纤维素酶处理可显著降低艾草青贮的NDF和半纤维素含量，这与本研究结果相似。TDN含量是衡量饲料养分整体性营养品质好坏和饲料采食量的重要指标，其含量越高表明饲料养分越全面[27-28]。本试验中，与CK组相比，X和FX组青贮饲料TDN含量显著升高，且FX组青贮饲料TDN含量最高，说明青贮中同时添加复合菌制剂和复合酶制剂能够提高饲料利用率。通过对青贮营养成分分析，表明复合菌制剂和复合酶制剂联用可降低纤维含量，较好地保存柠条锦鸡儿青贮饲料营养成分，具有较高的饲喂价值。

3.2 添加剂对柠条锦鸡儿青贮发酵特性的影响

pH、有机酸和NH3-N含量能够直观反映青贮饲料发酵品质，其中乳酸含量越高，NH3-N、丙酸和丁酸含量越低，青贮品质越好[28-29]。与CK组相比，F、X和FX组青贮饲料pH均降至4.2以下，且未检测到丁酸，说明青贮饲料品质较好[29]。酶制剂可以促进柠条锦鸡儿青贮纤维降解，增加发酵底物，从而促进乳酸菌发酵，并提高青贮饲料乳酸含量。本试验中，复合菌制剂中的酵母菌和植物乳酸杆菌在发酵过程相互促进，酵母菌产生的维生素、氨基酸和生长因子等促进乳酸菌生长[30]。此外，酵母菌还可利用酶制剂降解植物细胞壁所产生的单糖和双糖等小分子化合物，刺激乳酸菌繁殖[31]。因此，复合菌制剂和复合菌制剂和复合酶制剂联用通过提高柠条锦鸡儿青贮乳酸菌数量，增加了乳酸含量，从而抑制丙酸生成。青贮饲料中NH3-N主要由植物酶和微生物降解蛋白质等含氮物质所产生，反映了青贮中蛋白质分解程度，NH3-N/TN越低则蛋白质分解程度越小，越有利于家畜采食[32]。本试验中，F、X和FX组青贮饲料NH3-N/TN均显著低于CK组，且FX组青贮饲料NH3-N/TN最低，这说明复合菌制剂和复合酶制剂联用能够较好地保存柠条锦鸡儿的蛋白质。有研究表明，青贮中添加植物乳酸杆菌和纤维素酶等生物添加剂可降低pH，抑制植物酶和有害微生物对青贮饲料中蛋白质降解，从而有效降低NH3-N含量，提高青贮饲料营养价值[8]。在青贮60 d后，各组V-Score评分等级均为良好。以上分析表明，复合菌制剂和复合酶制剂联用对柠条锦鸡儿青贮发酵品质的改善效果优于二者单独使用，同时许多研究也表明在青贮过程中同时添加酶制剂和菌制剂有利于提高青贮发酵品质[26]。因此，同时添加复合菌制剂和复合酶制剂提高了柠条锦鸡儿发酵品质。

3.3 添加剂对柠条锦鸡儿青贮微生物数量及有氧稳定性的影响

乳酸菌是青贮成功的关键微生物，其在厌氧环境下利用碳源促进自身繁殖，从而产生大量乳酸，使pH迅速降至4.2以下，并有效抑制有害微生物生长繁殖[33]。本试验中，F、X和FX组青贮饲料乳酸菌数量显著高于CK组，而F和FX组青贮饲料乳酸菌含量较高，这与孙贵宾等[33]对全株玉米青贮品质的研究结果一致。本试验结果说明，复合菌制剂中的乳酸菌在发酵过程中成为柠条锦鸡儿青贮的优势微生物，主导青贮发酵进程。在厌氧环境下，酵母菌可分解糖产生乙醇，并在好氧环境下氧化糖产生水和二氧化碳，使青贮饲料具有酒香味[10]。本试验中，F组青贮饲料酵母菌数量显著高于CK组，这可能是由于添加复合菌制剂的同时增加了酵母菌含量，而FX组青贮饲料酵母菌数量显著低于CK和X组，可能是由于FX组中富含乳酸菌，可产生大量的乳酸，降低了青贮饲料pH，从而抑制了酵母菌繁殖。

青贮饲料一旦与空气接触，酵母菌和霉菌等好氧微生物开始活跃，并利用青贮中营养物质大量繁殖，致使青贮饲料变质[34]。本试验中，柠条锦鸡儿青贮在开袋49 h后开始变质。乙酸是影响青贮饲料有氧稳定性的重要因素之一。有研究发现，在青贮发酵后期，较高的乙酸含量能够抑制不良微生物生长，降低其最大生长速率，从而使有氧稳定性增加[35]。本试验中，X和FX组有氧稳定性均得到了改善，而X组青贮饲料乙酸含量高于FX组，有氧稳定性更好，说明柠条锦鸡儿青贮中较高的乙酸含量能够抑制酵母菌生长，提高青贮饲料有氧稳定性。

4 结 论

① 从营养品质来看，复合菌制剂和复合酶制剂联用比单独添加在降低柠条锦鸡儿青贮的WSC、NDF、ADF含量和提高TDN含量方面效果更佳。

② 从发酵特性来看，复合菌制剂和复合酶制剂单独添加和联用均可降低柠条锦鸡儿青贮的pH和NH3-N含量，提高乳酸含量和乳酸菌数量；复合菌制剂和复合酶制剂联用比单独添加在降低丙酸含量、酵母菌数量和提高乳酸/乙酸方面效果更佳。

③ 复合酶制剂单独添加及复合菌制剂和复合酶制剂联用提高了柠条锦鸡儿青贮的有氧稳定性。

④ 本试验中，综合营养品质、发酵特性和有氧稳定性，复合菌制剂和复合酶制剂联用对柠条锦鸡儿青贮品质改善效果最好。