HPLC-ELSD 测定桔贝合剂中桔梗皂苷D 含量

洪挺，章瑛，周志强，陈丹丹，杨毅生

1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004

桔贝合剂处方来源于重庆市中医研究所（原重庆市第一中医院）的院方制剂——桔贝糖浆，后改为合剂，但为了矫味，处方中仍保留了20%的糖量。桔贝合剂的处方主要由桔梗、浙贝母、苦杏仁、麦冬、黄芩、枇杷叶、甘草七味药材组成，具有润肺止咳的功效，临床上主要用于肺热咳嗽、痰稠色黄、咳痰不爽等［1］。据文献报道，桔贝合剂联合布地奈德治疗小儿支气管炎、肺炎的痊愈率与有效率均有提高［2］。桔梗作为处方中的君药之一，主归肺经，具有宣肺、利咽和排痰之功效。临床主治痰多、咳嗽，胸闷不畅，喉咙痛，声音嘶哑，肺痈吐脓等症状［3］。桔梗药材的主要化学成分为皂苷类、酚酸类、黄酮类、甾醇类等，而大量文献均报道桔梗皂苷D 是其主要活性成分，具有祛痰止咳、抗肿瘤、抗炎、护肝、杀精、抗动脉粥样硬化、免疫调节等良好的药理活性［4-10］。桔贝合剂现行标准为《卫生部药品标准·中药成方制剂》（第二册），该标准仅有性状与检查项，标准非常简单，亟须提高。经查阅文献发现目前对桔贝合剂的研究主要集中在浙贝母、黄芩的含量测定和枇杷叶的薄层鉴别研究，而对君药桔梗的研究未见报道［11-13］。本研究参照《中国药典》2020年版一部中桔梗药材的含量测定方法及有关文献报道［3,14-17］，采用HPLC-ELSD 法对桔梗皂苷D 进行含量测定研究，以便更好地控制桔贝合剂的质量并保证其疗效的发挥。

1 仪器与试药

仪器：安捷伦1260Infinity Ⅱ型HPLC 色谱仪（美国安捷伦公司）；ELSD 检测器（奥泰公司）；Sartorius BT25S 电子天平（十万分之一，德国赛托利斯公司）。

试剂：乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

对照品：桔梗皂苷D（批号：111851-201103，含量以96.9%计，中国食品药品检定研究院）。

样品：36 批次桔贝合剂（A 公司20 批次，B 公司9 批，C 公司7 批）。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的制备 取桔梗皂苷D 对照品适量，精密称定，加甲醇溶解后，制成0.3 mg/mL 的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取桔贝合剂样品溶液20 mL，用水饱和正丁醇萃取4 次，每次30 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的氨试液洗涤2 次，每次40 mL，取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5 mL 量瓶中，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 取缺桔梗的其他药材，按处方工艺制成阴性样品，再按“2.1.2”的方法制备阴性对照溶液。

2.1.4 空白溶液的制备 取甲醇溶液，即得。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流动相：乙腈-水（25:75）；柱温：20 ℃；ELSD 检测器，漂移管温度100 ℃；气体流速2.5 mL/min。理论板数按桔梗皂苷D 峰计算应不低于3 000。

精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液及甲醇的空白溶液各10 μL，按上述色谱条件测定，比较对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液及空白溶液的色谱图，结果阴性样品及空白均无干扰，见图1。

图1 HPLC色谱图：A.桔梗皂苷对照品；B.供试品；C.阴性样品；D.空白

2.3 线性关系的考察

精密称取10.46 mg 桔梗皂苷D 对照品，置10 mL 量瓶中，加甲醇超声溶解后，再稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液。再精密吸取该母液1、2、3、5 mL，分别置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品稀释液，精密吸取对照品稀释液和母液各10 μL 进样测定，以Y（Lg 峰面积)为纵坐标，X（Lg 进样量）为横坐标，作回归方程，桔梗皂苷D 回归方程为Y=1.581 7X+2.295 3，r=0.999 9。结果见表1。结果表明桔梗皂苷D 进样量在1.013 6～10.135 7 μg 之间与峰面积呈良好对数线性关系。

表1 桔梗皂苷D线性关系测定结果

2.4 精密度试验

取对照品溶液，按“2.2”项下HPLC 条件，连续进针6 次，结果桔梗皂苷D 峰面积相对标准偏差为3.5%，符合实验测定要求。

2.5 重复性试验

取样品（C 公司，批号：19090030）6 份，照“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液，测定，结果桔梗皂苷D 的平均含量为0.18 mg/mL，相对标准偏差为0.1%，表明该方法重现性良好。

2.6 稳定性试验

取同一份供试品溶液，按“2.2”项下HPLC 条件，按间隔时间要求进样，结果桔梗皂苷D 色谱峰面积在24 h 内无明显变化，相对标准偏差为0.6%，表明桔梗皂苷D 在24 h 内稳定性良好。

2.7 回收率试验

采用加样回收试验，精密量取重复性项下已经测定含量的本品（C 公司，批号：19090030，含桔梗皂苷D 0.18 mg/mL）6 份，每份10 mL，分别置分液漏斗中，精密加入桔梗皂苷D 对照品溶液（浓度1.013 6 mg/mL）2 mL，再按“2.1.2”项下方法萃取4 次，每次30 mL，其余步骤同法操作，计算回收率，结果详见表2。

表2 桔梗皂苷D回收率试验结果

2.8 耐用性试验

取样品，照“2.1.2”项下方法，分别采用Phenomenex C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Sunfire-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 种不同品牌的色谱柱进行耐用性考察，结果桔梗皂苷D 在上述色谱柱中均分离良好，桔梗皂苷D 测定结果相对标准偏差为2.5%，桔梗皂苷D 含量差异无统计学意义，耐用性符合要求。

2.9 样品测定

取样品36 批，照前述方法制备和测定，从测定结果可知，不同企业样品中桔梗皂苷D 含量差异巨大，其中A 公司样品桔梗皂苷D 含量普遍偏低，且批间差异大。测得不同企业桔梗皂苷D 所测含量最高值比最低值高11 倍。测定结果见表3。

表3 桔贝合剂样品测定结果

3 讨论

桔梗作为桔贝合剂处方中的君药之一，对其质量进行控制存在必要性，而桔梗皂苷D 又是桔梗的主要活性成分，选用其作为含量测定指标，研究意义大且专属性较好。本研究在前期对桔梗皂苷D 进行紫外扫描，发现其紫外吸收弱，因为桔梗皂苷D 没有共轭基团，只有一个碳碳双键［18］，故而不能用紫外检测器进行检测。ELSD 检测器不依靠被检测样品的光学特性，对无紫外或紫外吸收较弱的样品均可检测，且ELSD 的响应值是与样品质量成正比［17,19］。所以本研究选用HPLCELSD 方法对桔梗中的桔梗皂苷D 进行含量测定。经过多次色谱条件及样品前处理等条件的摸索，最终选择以乙腈-水（75∶25）为流动相进行等度洗脱、以水饱和的正丁醇作为提取媒介，ELSD的漂移管温度100 ℃，气体流速2.5 mL/min，此时的基线平稳、峰形对称、主峰与其他峰无干扰、杂质峰较少。

从测定结果可知，不同企业样品中桔梗皂苷D含量差异巨大，其中A 公司样品桔梗皂苷D 含量普遍偏低，且批间差异大。测得不同企业桔梗皂苷D 含量最高值比最低值高11 倍。桔梗药材在处方工艺中仅经水煎煮，工艺简单，造成桔梗皂苷D 含量差异大，可能是不同企业所用桔梗药材质量差异造成的。由此可见，对桔梗药材的质量进行控制有一定的必要性与紧迫性。