道地中药材川贝母特异性PCR鉴别方法研究

张富丽，张义蓉，兰青阔，杨晓凤，刘 炜，付绍兵，刘 茜，陈 敏，尹 全

（1四川省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，成都 610066；2天津市农业科学院种质资源与生物技术研究所，天津 300381；3青海绿康生物开发有限公司，青海 海东 810500）

0 引言

川贝母为百合科(Liliaceae)贝母属(Fritillaria)多种植物[川贝母（卷叶贝母）(Fritillaria cirrhosa)、暗紫贝母(Fritillaria unibracteata)、甘 肃 贝 母 (Fritillaria przezvalskii)、梭砂贝母(Fritillaria delavayi)、太白贝母(Fritillariataipaiensis)或瓦布贝母(Fritillaria unibracteata var.wabuensis)]干燥鳞茎的总称[1-2]。它生长在广大高海拔地区，处在青藏高原的边界。它味道微苦，具有清热润肺、止咳化痰的功效[3-4]，是中医治疗中常用的名贵药材，也是许多保健食品的重要原料。受限于生长环境条件和栽培技术，川贝母类资源短缺，商品价格一直居高不下，需求量大，致使一些不法分子用其他类似的药材混充川贝母销售，导致市场上出现了众多的混淆品和伪品，严重影响川贝母的市场秩序，损害消费者的利益[5]。中药材是传统医术指导下应用的原生药材，讲究地道药材，其品质和疗效受品种、特定自然条件、生态环境的地域影响明显[6]。药材是否真实、正统，直接影响其使用价值和经济价值。浙贝母(Fritillariae thunbergii)、湖 北 贝 母 (Fritillaria hupehensis)、平 贝 母 (Fritillaria ussuriensis)、伊 贝 母(Fritillaria pallidiflora)、土 贝 母 (Bolbostemma paniculatum)、光慈姑(Tulipa edulis)等是常见的川贝母的混淆品及伪品[7-8]。通常情况下，贝母伪品与正品虽然外观相似，但药用价值和营养价值相差甚远，甚至还含有对人体有害的成分，对药用和食用安全造成极大的威胁[7]。因此，科学有效的川贝母真伪鉴定技术对于打击制售假的不法行为、保障用药及食用安全具有非常重要的意义。

川贝母真伪鉴定主要通过性状[8]、显微[8]、理化[9-12]等传统的鉴别方法实现，但受主观经验判断或环境因素影响大。随着分子检测技术在中药材鉴定中逐渐得到应用和推广，川贝母鉴定手段亦从形态表征的宏观观测扩展到了遗传物质DNA的微观探测。《中国药典》2020版[1]中收录的基于贝母属核糖体DNA(nr DNA)中的Internal Transcribed Spacer(ITS)核酸序列建立的聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP)鉴定方法，是目前川贝母真伪鉴定参考的重要技术标准。但研究结果表明，尽管该方法经过数次体系改进优化，仍然无法避免在川贝母药材（干鳞茎）鉴定中产生非特异性条带，易影响结果判断[13-14]。且该方法需要对PCR反应产物进行酶切后凝胶电泳检测，耗时相对较长。陈士林[15]基于ITS2序列构建NJ树的条形码检测技术，解决了多数中药材的真伪鉴别问题，也适用于川贝母的真伪鉴定。但该法需要PCR扩增，还需要测序比对数据库，耗时长、费用高。为进一步简化程序，近年来有研究者利用SYBR Green I染料和荧光探针建立PCR技术鉴定川贝母真伪[16-17]。但SYBR Green I法受非特异性产物影响大，易导致高背景和假阳性而影响鉴定结果准确性[18]。探针法具有高特异性[19]，但需合成价格较高专用探针，且需费用高昂的设备配套，经济适用性差，不利于技术推广。此外，包括《中国药典》中DNA条形码分子检测方法、PCR-RFLP方法在内，现有川贝母分子检测技术多基于ITS区序列建立。ITS1和ITS2是中度保守区域，其保守性具有种内相对一致、种间差异明显的特点，ITS常用于物种的分子鉴定以及属内物种间或种群的系统发育关系分析[20-21]。但由于ITS片段不加入成熟核糖体，在物种进化过程中承受的自然选择压力小，容易发生碱基突变[20]。作者推测这是导致川贝母PCR-RFLP鉴定方法中PCR扩增出现非特异性条带或条带模糊不清的重要原因。特异而稳定的内源基因代替ITS序列作为物种鉴定的基因标记可以克服这样的问题。因此，本研究筛选克隆川贝母特异内源基因序列，以此为基础建立高特异PCR分子检测技术，以期为川贝母真伪鉴定提供新的技术选择。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究中所用的实验样品具体来源和信息见表1。对照药材川贝母（暗紫贝母）（批号121000）购自中国食品药品检定研究院。川贝母干燥鳞茎样本由青海绿康生物有限公司搜集，其中卷叶贝母(1-JY-KD)、暗紫贝母(2-AZ-SP)、梭砂贝母(3-SS-KD)、甘肃贝母(5-GS-ZX)分别来自四川、青海、云南、甘肃等地。瓦布贝母(4-WB-SP)采自四川松潘，太白贝母(6-TB-WX)采自重庆巫溪。浙贝母(7-ZBM1)、湖北贝母(8-HBBM)、伊贝母(10-YLBM)、平贝母(9-PBM1)由青海绿康生物有限公司惠赠。土贝母(12-TBM1)、光慈姑(11-GCG)购自华御堂中药材淘宝店、药王堂淘宝店。10个含“贝母”标识商品购自成都中药材市场、药店、阿里健康大药房淘宝商城、同芙天猫旗舰店和藏禧堂、栢晟、善一坊等京东商城等，在本研究中作为待测样品(13-T～22-T)。

表1 样本信息表

1.2 总基因组DNA的提取

参考张富丽等[22]的方法从样品中分离纯化总基因组DNA。使用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计(Thermo Scientific，USA)测定OD260/OD280和OD260/OD230评价样品DNA的质量。

1.3 川贝母特异基因片段克隆

从NCBI数据库中搜集贝母甾体皂苷生物合成关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)功能基因同源片段，设计兼并引物HMGR-F2(5’-AC(A,T,C)ATGCC(A,T)TC(A,T,C)AT(T,C)GAGGT-3’)/HMGRR2(5’-GTT(A,G)TA(T,C)TTCATGTGGCTCT-3’)。以川贝母、浙贝母、湖北贝母、伊贝母鳞茎样本DNA为模板，利用 1× HotStar Taq®Plus Master Mix(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)、HMGR-F2/HMGR-R2引物对进行PCR扩增分析，回收特异条带进行克隆测序。根据川贝母与其他贝母中得到的序列中不同碱基位点，设计川贝母特异的引物BMH-F2(5’-AGCGAGAGACGACATCAGAGA-3’)/BMH-R2(5’-AGGTTGGCACAGTTGGAGG-3’)。再次以川贝母样本DNA为模板，利用引物BMH-F2/BMH-R2引物进行PCR扩增，得到川贝母基源样本特异性条带，回收并送克隆测序。进一步地设计引物BM-P1(5’-ACCGC TGCCCAGACCTA-3’)、BM-P2(5’-CCGTTCCTCCA ACTGTGC-3’)、BM-P3(5’-AGAACATCAGAAAAAA TCCGTG-3’)、BM-P4(5’-ATCGGGGAAACGACCCT ATC-3’)分别用于先后2次步移克隆。用EcoRV、DraI、PvuⅡ和StuⅠ（BD Genome WalkerTMUniversal Kit，Clontech公司）4种内切酶构建川贝母全基因组酶切库，步移克隆操作按试剂盒说明书进行。PCR反应条件为94℃ 4 min；94℃ 30 s，57℃ 40 s，72℃ 45 s，32个循环；72℃延伸6 min。扩增产物用2.0%琼脂糖胶进行电泳分析，回收特异性带并送擎科生物（Tsingke Biological Technology，成都）克隆测序。采用Primer Premier 5.0（Premier公司，加拿大）进行引物设计，用AlignX软件及DNAman软件对序列进行同源性分析及拼接。

1.4 川贝母基因片段物种特异性验证

根据从川贝母中得到的核酸序列，设计川贝母特异性检验引物BMH-TF(5’-CGAGAGACGACATCAG AGAACTT-3’)/BMH-TR(5’-CTTGGGATTGCTACTG CGTTA-3’)以及BMH-YF(5’-CAGCAGGAATCCCAA GC-3’)/BMH-YR(5’-GGTTGGCACAGTTGGAGG-3’)分别在120、234 bp位点和不同靶标长度进行验证。以卷叶贝母、暗紫贝母、梭砂贝母、甘肃贝母、瓦布贝母、太白贝母等所有贝母基源DNA为模板进行PCR扩增，反应条件同上。

1.5 高特异PCR方法建立

以 BMH-TF(5’-CGAGAGACGACATCAGAGAACTT-3’)/BMH-TR(5’-CTTGGGATTGCTACTGCGTTA-3’)为引物，以50 ng/μL川贝母DNA为模板，1× Hot-Star Taq®Plus Master Mix(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)优化PCR反应体系。配制0.1、0.12、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L不同浓度梯度引物，在50、52、54、56、58、60、62℃不同退火温度下进行扩增分析，取最优引物浓度和最适退火温度作为川贝母PCR检测条件。

1.6 方法学验证

以川贝母各基源种、浙贝母、湖北贝母、平贝母、伊贝母、土贝母、光慈姑DNA为模板，采用本研究中川贝母特异检测引物及构建的PCR方法进行扩增分析，测试方法的特异性。

将川贝母DNA模板进行不同浓度梯度稀释后作为模板，采用川贝母特异检测引物及构建的PCR方法验证测试方法的检测下限，即灵敏度。

同时采用本研究中构建的PCR方法对市场中购买样品进行检验测试，每个样品重复检测3次，每次设3个平行样品。采用《中国药典》（2020版）[1]中RFLPPCR方法平行地验证构建方法的有效性，测试方法的准确性、稳定性和重现性。

2 结果与分析

2.1 川贝母特异基因片段

通过兼并引物对HMGR-F2/HMGR-R2从川贝母中得到501 bp核苷酸序列，经比对与Fritillaria unibracteata 3-hydroxy-3-methyl qlutaryl coenzyme A reductase(HMGR)mRNA序列有99%同源性。在此基础上，在川贝母与浙贝母、湖北贝母、伊贝母等同源基因差异最大区域设计特异引物，在川贝母中得到341 bp特异序列（图1A），进一步通过步移克隆得到610 bp特异核酸序列（图1B）。将该序列提交至NCBI Genbank库，登录号为MN151370。分别在2个不同位点、不同靶标长度设计BMH-TF/BMH-TR和BMH-YF/BMHYR引物对，以川贝母DNA为模板，PCR扩增分别得到120、234 bp特异性条带（图1A），明确本研究中克隆得到的片段为川贝母基源种特异基因序列。

图1 川贝母特异基因片段及引物位置示意图

2.2 川贝母特异PCR检测方法建立

不同引物浓度在不同退火温度下的扩增分析结果如图2A所示，引物浓度0.4 μmol/L、退火温度56℃为扩增得到清晰、特异性条带的最佳条件。采用BMHTF/BMH-TR引物对，在上述条件的PCR条件下，可在川贝母阳性对照品(P121000)、卷叶贝母(1-JY-KD)、暗紫贝母(2-AZ-SP)、梭砂贝母(3-SS-KD)、瓦布贝母(4-WB-SP)、甘肃贝母(5-GS-ZX)、太白贝母(6-TB-WX)等川贝母基源中扩增到120 bp单一清晰目标带，而在阴性对照(Water)以及浙贝母(7-ZBM1)、湖北贝母(8-HBBM)、平贝母(9-PBM1)、伊贝母(10-YLBM)、光慈姑(11-GCG)和土贝母(12-TBM1)等非川贝母中不产生扩增条带（图2B）。以上结果表明，引物BMH-TF/BMHTR可对川贝母对照品及川贝母基源物种进行特异性扩增，本研究中建立的PCR方法对川贝母具有特异性。

2.3 灵敏度

将100 ng/μL的川贝母对照品(P121000)DNA模板分别稀释为50、25、10、5、2、0.5、0.1、0.05 ng/L后，取2 μL作为模板，即50 μL反应体系中分别含有100、50、20、10、4、1、0.2、0.1 ng川贝母DNA。以无菌水作为空白对照，采用本研究中构建的特异PCR方法进行50 μL体系扩增分析。如图2C所示，当DNA模板稀释至2 ng/μL以上，即体系中DNA模板量≥4 ng时，特异性条带扩增明显且单一。当DNA浓度稀释至0.5 ng/μL时，能微弱地看到扩增条带，但相对模糊，之后的稀释模板均无扩增条带产生。由此，确定该方法检测灵敏度为2 ng/μL，检测下限为4 ng。

图2 川贝母基源特异性检测及检测灵敏度

2.4 方法适用性分析

为验证构建方法的准确性及重现性，笔者从各种渠道购买10个样品，其中5个样本(13-T、14-T、17-T、19-T、22-T)明确标注为川贝母或川贝（母）粉、3个样本(16-T、20-T、21-T)标注为贝母或贝母粉、2个样本(15-T、18-T)分别标注为“平贝母”、“浙贝母”。同时采用本研究中构建的PCR方法和《中国药典》（2020版）中RFLP-PCR方法[1]平行地对10个从市场中购买样品(13-T～22-T)进行检验测试，以川贝母对照品(P121000)DNA为阳性对照、Water为阴性对照。PCR扩增结果表明，3次重复检测结果均一致，具有良好重现性。5个明确标注为川贝母或川贝（母）粉样本中，编号为22-T的样本中未检测到川贝母特征条带。而标注为贝母的3个样本中，仅21-T这个样本扩增到特异条带。编号为15-T的平贝母和18-T的浙贝母中均未扩增到目标条带。依据本研究中建立的PCR检测方法判定，含“川贝母”或“贝母”标记的8个在售商品样品中，仅有5个样本含有川贝母成分，阳性率仅为62.5%（表2）。采用RFLP-PCR方法平行检测结果与上述结果一致，本文中所示的PCR检测方法稳定性好，准确性佳，适用于实际样品分析检测。

表2 川贝母特异PCR方法在实际样品分析中的适用性

3 讨论

川贝母作为一种名贵中药材，具有特殊的生境适应性，其止咳化痰功效优于其他贝母种类。萜类化合物是许多植物体中维持生长发育、应对环境胁迫、抵御病原体和害虫侵袭等重要功效物质的主要成分[23]，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR)是该物质合成代谢的关键限速酶，能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化成中间代谢产物甲羟戊酸[24]。因此，本研究欲将HMGR基因作为寻求川贝母基原物种特异性分子标记的突破点。如预期所料，笔者在克隆HMGR同源基因过程中，在川贝母基因组中扩增得到其他贝母中未有的条带，且经过测序及不同引物、不同位点验证，明确了其物种特异性。虽然该核酸序列与川贝母特殊生境适应力及优秀的药用功效间的关系尚待进一步研究，但本研究基于该段序列建立特异PCR检测方法，可简单有效地鉴别川贝母基原与非川贝母，且实验验证了该鉴定方法的稳定性、重现性。由于本文中获取的特异核酸片段来自于川贝母基因组，检测模板易获取，不受材料完整度、干燥程度的影响。设计的引物具有较强的特异性，目标片段大小适中，应用该引物可实现川贝母与其近缘物种快速准确鉴别。这是在ITS以外，基于内源基因片段建立川贝母基源鉴定方法的一次新的重要尝试，希望能为中药材基原鉴定新方法研究及标准化技术体系建立提供参考。