桃叶卫矛茎段愈伤组织诱导及不定芽再生体系的建立

李瑞静，田 菊,2，刘 洋,2

（1内蒙古和盛生态科技研究院有限公司，呼和浩特 011517；2内蒙古农业大学，呼和浩特 010019）

0 引言

园林绿化建设既是城市经济全面快速发展的重要推动力量，也是保护城市生态环境、提升和优化人们的审美品味的重要基础[1]，实践证明，城市园林绿化的过程中，观果树种具有非常重要的价值和作用。在园林绿化建设过程中，需充分全面地发挥观果树种的价值，更好地提升城市园林绿化的建设成效，保护城市生态环境[2]。桃叶卫矛(Euonymus maackii)又名丝棉木、白杜、明开夜合，卫矛科卫矛属落叶小乔木[3]，是园林绿化中不可多得的优良材料，除了具有抗逆性能力强、养护成本低、取材方便等特点，还兼具彩色、适应范围广、病虫害少等优点，是丰富园林绿化树种的优良种质资源[4]。桃叶卫矛无性繁殖技术研究是加大桃叶卫矛优株在园林绿化中应用的基础。目前，桃叶卫矛无性繁殖方法主要有嫁接、扦插等。上述无性繁殖方法对繁殖材料需求量大，不适用于材料有限的优良单株进行大量繁殖，且嫁接繁殖成活率低、扦插繁殖系数小、周期长、受气候条件影响大、生产成本高，不利于工厂化育苗生产。组培繁殖技术具有繁殖系数大，节约繁殖材料，能保持原有品种优良性状，不受自然环境和季节的影响，可进行工厂化生产的优势。开展桃叶卫矛的组培繁殖技术研究，对促进桃叶卫矛的良种选育、优质苗木规模化生产均具有非常重要的意义。

关于桃叶卫矛组培繁殖技术研究，李春玲等[5]以桃叶卫矛的嫩茎为材料，通过诱导产生腋芽建立桃叶卫矛再生体系，但并未开展桃叶卫矛的组培继代繁殖系数研究。李晓青等[6]以桃叶卫矛当年生嫩茎为外植体，诱导产生腋芽建立桃叶卫矛再生体系，其腋芽成芽率最高可达50%，继代增殖系数最高为3.3，平均生根数最多为2.7。吴建华等[7]以桃叶卫矛幼嫩叶片为材料，建立桃叶卫矛再生体系，其增殖系数为3.6。已知桃叶卫矛继代增殖系数平均水平为3.0左右，利用现有组培繁殖技术工厂化生产时，发现其继代系数低，不能满足规模化生产。此外，研究表明，愈伤组织再生能力强，可用于研究植物生长发育及分化机制、遗传变异规律等，因此，愈伤分化体系研究对桃叶卫矛品种改良具有重要意义。同时，大多数能进行组培繁殖的林木，都能以腋芽萌发途径建立组培繁殖体系，但以腋芽萌发为主要途径的组培增殖率通常低于愈伤组织诱导丛生芽的增殖率[8]。因此，本研究以桃叶幼嫩茎段为材料，获取桃叶卫矛茎段愈伤组织诱导、分化及生根的最佳培养基组合，建立高效茎段愈伤组织再生体系，以期为桃叶卫矛优株繁育提供理论支持，为研究遗传转化体系提供材料。

1 材料与方法

1.1 材料

选择蒙树生态科技园2016年自沈阳市引种的高2～3 m、胸径2～4 cm、生长健壮、树形优美、无病虫害的桃叶卫矛优良单株为材料，采集当年生幼嫩枝条。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒 将采集的当年生茎段，去掉叶片置于组培瓶中，用医用纱布蒙上瓶口，自来水下冲洗30 min后放在超净工作台中，75%的酒精消毒30 s，无菌水冲洗3～5次后，分别用20%的次氯酸钠和0.10%的升汞进行消毒处理，处理时间为8、10、12 min，消毒处理完成后再次用无菌水冲洗4～5次，无菌滤纸吸水后，接种到MS+0.05 mg/L NAA培养基中。每个处理接种15个外植体，重复3次。7天后观察染菌和萌芽情况。

1.2.2 培养条件 温度为(25±5)℃，光照强度为2000～2200 lx，光处理时间为12～14 h/d，暗处理时间为10～12 h/d。

1.2.3 愈伤组织诱导 启动培养基中培养一段时间待腋芽萌发后，将新生幼苗剪成约1 cm的茎段分别接种于不同愈伤组织诱导培养基中培养，即6-BA浓度为0.5、1.0、1.5 mg/L，NAA浓度为0、0.05、0.10 mg/L的正交组合。每个处理接种15个外植体，重复3次，观察愈伤组织分化情况。

1.2.4 不定芽分化诱导 诱导出愈伤组织后，将愈伤组织分别接种于不同不定芽诱导培养基中培养，即6-BA浓度分别为0.5、1.0、1.5 mg/L，NAA浓度分别为0.05、0.10、0.15 mg/L。每个处理接种15个外植体，重复3次，培养观察不定芽诱导情况。

1.2.5 继代增殖培养 选取3～4 cm的无菌苗，转接到不同继代增殖培养基中，即6-BA浓度分别为0.15、1.0、2.0 mg/L，NAA浓度分别为0.10、0.15、2.0 mg/L。每个处理接种15株，3次重复。20天后统计增殖倍数和株高差。

1.2.6 生根诱导 诱导出不定芽后，将不定芽分别接种于不同生根培养基中培养，IBA浓度分别为0.1、0.3、0.4、0.5 mg/L，NAA浓度分别为0.1、0.2、1.0 mg/L。另外以添加0.3 g/L或不添加碳粉探索碳粉对生根的影响。每个处理接种15个外植体，重复3次培养观察生根情况。

1.3 数据统计与分析

启动培养基培养20天后统计污染率与腋芽萌芽率；愈伤组织诱导培养基中培养30天后，统计愈伤组织诱导率、愈伤组织生长状况；不定芽诱导培养30天后统计不定芽分化率、不定芽苗高、不定芽生长状况；生根诱导30天后统计生根率、平均生根数、平均生根长度。将收集到的数据利用SAS 9.0统计软件和Excel进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对外植体消毒效果的影响

同一消毒剂，消毒时间影响消毒效果。试验结果（表1）表明，处理1污染率与其他处理下的污染率存在显著性差异。处理6污染率最低，未出现污染情况，消毒效果最好，但其顶芽伤害程度严重，导致腋芽萌芽率最低，其他处理消毒效果无明显差异。处理3腋芽萌芽率最高，可达96%，其污染率低，为2%。考虑腋芽萌芽率为主要选择因素、兼顾污染率时，选择20%的次氯酸钠消毒处理12 min作为桃叶卫矛茎段最适消毒处理。

表1 消毒剂种类及消毒时间对桃叶卫矛外植体的影响

2.2 不同浓度植物生长调节剂配比对愈伤组织诱导效果的影响

试验结果（表2）表明，不同的植物生长调节剂浓度配比均能利用茎段诱导出愈伤组织，但其诱导率不同，生长状况不同。9种植物生长调节剂配比方案中，处理6愈伤组织诱导率最高，为80.00%，愈伤面积大、生长快（图1A）；处理9下的愈伤组织诱导率为53.33%，愈伤不明显、生长慢、颜色褐色（图1B）；处理2愈伤组织诱导率为48.89%，愈伤面积小、生长慢、颜色变为褐色（图1C）；其他处理愈伤诱导效果差，愈伤速度慢，诱导率均低于40.00%。因此，桃叶卫矛利用茎段进行愈伤组织诱导最佳植物生长调节剂配比方案为1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。

图1 桃叶卫矛愈伤组织诱导情况

表2 植物生长调节剂对愈伤组织诱导效果的影响

2.3 不同浓度植物生长调节剂配比对不定芽诱导效果的影响

表3结果表明，不同浓度植物生长调节剂配比均能诱导出不定芽，而不定芽诱导率及生长情况受植物生长调节剂浓度配比影响。处理1不定芽分化率达91.11%，不定芽分化明显、生长快、幼苗健壮（图2A）；处理5不定芽诱导率为66.67%，分化较为明显，生长慢、幼苗细弱（图2B）；处理4不定芽诱导率为61.59%，分化较为明显、生长缓慢、幼苗矮小（图2C）。综上可得，利用愈伤组织诱导出不定芽的最佳植物生长调节剂配比方案为0.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。

图2 桃叶卫矛不定芽分化情况

表3 植物植物生长调节剂对不定芽诱导效果的影响

2.4 不同浓度植物生长调节剂配比对继代增殖的影响

不同浓度植物生长调节剂配比对桃叶卫矛继代增殖结果有不同的影响（图3A～B）。由表4可以看出，处理5增殖倍数最高，为6.0倍，但NAA浓度过高会使得苗木之间的株高差较大，降低了苗木的一致性，不利于后续的苗木培育。处理6由于NAA浓度高于6-BA浓度，继代苗只进行株高生长，几乎不进行分化，其增殖倍数低于1.0。处理4继代增殖倍数为6.0倍，株高差为0.1 cm，适合用于桃叶卫矛继代增殖。

表4 植物生长调节剂配比处理对继代培养的影响

图3 桃叶卫矛组织培养继代和生根情况

2.5 不同浓度植物生长调节剂配比及碳粉对组培苗生根的影响

培养基中IBA浓度为0.1 mg/L时，添加碳粉可增加生根长度（表5，图3C），其生根长度是同植物生长调节剂浓度下未添加碳粉的处理的1倍以上（图3D）；当IBA浓度逐渐增加时，添加碳粉的平均生根条数小于未添加碳粉的处理。处理1、处理3、处理4组培苗均不生根；处理8生根条数最多，且长度最长。因此选择1/2MS+IBA0.3 mg/L为桃叶卫矛最适生根培养基。

表5 不同植物生长调节剂处理对生根的影响

3 结论

本研究系统地从外植体消毒、愈伤组织诱导、不定芽芽诱导、继代增殖、生根等方面对桃叶卫矛组织培养技术进行了深入研究，最终得出桃叶卫矛最佳消毒方案为：20%的次氯酸钠消毒处理12 min，污染率为2%，腋芽萌发率为96%；茎段愈伤组织最佳诱导培养基为1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA；利用愈伤组织诱导出不定芽的最佳植物生长调节剂配比方案为0.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA；最佳继代增殖培养基为MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，最佳生根培养基为1/2MS+3.0 mg/L IBA。

4 讨论

利用组织培养技术建立无性繁殖体系的前提是建立无菌体系，因此保证外植体低污染率对建立组培体系十分重要[9]。而在外植体消毒过程中所选单株不同、采集部位不同、采集时间不同、消毒时间不同均可导致消毒效果存在一定差异[10]。樊祥义等[11]在对金叶桃叶卫矛外植体消毒研究中得出最佳的外植体为茎段，最佳消毒剂为0.1%升汞，最佳消毒时间为6 min，其污染率为10%、腋芽萌发率为81.1%。余慧等[12]对欧洲卫矛组织培养研究得出，以欧洲卫矛叶片为外植体时，最佳消毒剂为3%次氯酸钠，最佳消毒时间为18 min，其污染率为12.95%、叶片成活率为81.26%。袁云香等[13]研究表明，小果卫矛以嫩茎为外植体时最佳消毒剂为0.1%升汞，最佳灭菌时间为15 min，其污染率为2%、腋芽萌发率为92.33%。赵丽蒙等[14]研究得出卫矛茎段最佳消毒方法为0.1%升汞消毒8 min并加入2滴吐温-20，其污染率为17.67%、腋芽萌发率为59.67%，从其研究结果可以看出，此方法腋芽萌发率低，在消毒过程中消毒剂对外植体损伤明显。李军正等[15]研究表明，库普曼卫矛以叶片为外植体时的最佳消毒剂为0.1%升汞，消毒时间为5 min，其污染率为仅为4.6%，报道中未见腋芽萌发率统计。从上述研究结果中可以发现，以0.1%的升汞为消毒剂时，其污染率2%～17.67%，腋芽萌发率为59.67%～92.33%，而在本研究中，0.1%升汞灭菌12 min时腋芽萌发率仅为76%；以3%次氯酸钠为消毒剂时，其污染率为12.95%，叶片成活率为81.26%，而在本研究中，20%的次氯酸钠消毒处理12 min，污染率仅为2%，腋芽萌发率可达96%，在有效降低污染率的同时最大限度地降低了消毒剂对外植体的损伤。

植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导与分化过程具有重要作用，用于愈伤组织诱导与分化的植物生长调节剂通常为2,4-D、NAA、6-BA等[16]。袁云香等[17]以陕西卫矛幼茎为外植体，以MS培养基为基本培养基，采用正交试验研究了不同种类、浓度的植物生长调节剂及其组合对陕西卫矛愈伤组织诱导的影响，结果表明，最适愈伤组织诱导培养基为MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；而以小果卫矛的嫩茎为外植体，研究不同植物调节剂种类及浓度对其愈伤组织诱导的影响，结果表明，最适愈伤组织诱导培养基为MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D。胡丽娟[18]研究表明，陕西卫矛愈伤组织诱导最佳培养方案为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。上述研究结果表明，同一种植物生长调节剂的不同浓度及不同植物生长调节剂间的配比对卫矛属植物愈伤组织的诱导与分化产生效果不同。而目前暂未见桃叶卫矛愈伤组织诱导相关研究报道，本研究为桃叶卫矛以茎段为材料诱导愈伤组织提供最佳植物生长调节剂配比方案。

利用桃叶卫矛不同的外植体如成熟胚、腋芽[19]等进行组织培养繁殖技术研究已经取得了一定进展，但在继代增殖过程中桃叶卫矛仍存在增殖倍数低、生长状况不佳的问题，严重影响工厂化育苗效率。吴建华等[20]筛选出桃叶卫矛增殖培养最佳培养基为MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，增殖倍数为3.6，生根培养最佳培养基为1/2 MS+0.1 mg/L IBA，平均生根数为3。卜祥潘等[21]研究得到，火焰卫矛不定芽最佳增殖培养基为DKW+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA，其增殖倍数为3.73，最佳生根培养基为1/4WPM+IBA 2.0 mg/L，平均生根数为2.73。研究结果表明，卫矛属植物继代增殖倍数约为3～4之间，组培生根苗平均生根数为2～3之间，本试验通过调节植物生长调节剂配比，将桃叶卫矛继代苗增殖倍数提升至6倍，将平均生根数提升至5，大幅提升了桃叶卫矛继代苗增殖生产效率。

植物利用组织培养技术建立再生体系一般有器官再生途径和体细胞胚再生途径。器官再生途径是指植物在适宜的培养条件下诱导外植体产生不定芽和不定根等器官，再形成完整植株[22]。体细胞胚再生途径是指体细胞胚发生经历与合子胚相似的阶段，形成两极性的体细胞胚，然后形成完整的植株[23]；体细胞胚胎发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点，但体细胞胚诱导对材料要求较高、培养环境难以控制、诱导胚状体的发生较为困难，诱导率非常低[24]，器官再生途径对材料要求低，培养环境可控，诱导率高，并能较好地保持母体遗传性[25]。本研究以桃叶卫矛器官再生为途径建立桃叶卫矛无性繁殖完整体系。而在研究过程中笔者发现利用同一植物调节剂配比方案进行多次继代增殖会影响继代增殖率以及生根效果，同时在愈伤组织诱导过程中愈伤组织存在褐化问题需要继续开展相关研究工作。此外，桃叶卫矛根部与其他植物根相较而言具有乳白色、生长速度慢、缺乏韧性等缺点，上述问题暂未见相关报道解决。