两种亚菊属植物挥发油及其主要成分对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性

解子仪，逯佩玉，宁安琪，刘芯莹，王俊龙，张 继，梁俊玉

（西北师范大学生命科学学院，兰州 730070）

马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchusdestructor属于茎线虫属Ditylenchus[1]，是一种植物寄生线虫，寄主分布广泛，已报道的植物寄主多达90多种，可侵染包括当归Angelicasinensis、党参Codonopsispilosula在内的多种根茎入药的植物，严重影响受害中药材品质与产量[2,3]。近年来，随着当归等大宗中药材种植面积的扩大，尤其道地产区长期、高密度种植，造成线虫虫源积累，病害发生率逐年上升。药用植物线虫病害问题的日益突出，严重制约我国中药产业的发展[4-6]。

20世纪至今，对线虫的防控和治理主要依赖于化学合成杀虫剂，其长期的使用不仅导致线虫耐药性增强，而且化学制剂的残留对环境造成严重污染[7,8]。相对而言，植物挥发油因其具有低残留、无污染的特性，有望作为新型杀虫剂[9]。目前，植物挥发油在杀虫方面的研究较多[10]，如山奈Kaempferiagalangarhizome挥发油对线虫的触杀活性（LC50）为 0.092 mg/mL[11]；鸡骨柴Elsholtziafruticosa挥发油对线虫的触杀活性（LC50）为 0.16 mg/mL[12]；野花椒Zanthoxylumsimulans挥发油对线虫的触杀活性（LC50）为 3.98 mg/mL[13]。然而，亚菊属植物挥发油对于绿色防控马铃薯腐烂茎线虫的研究相对较少，且亚菊属部分植物的挥发油已被报道具有明显触杀马铃薯腐烂茎线虫的活性，如铺散亚菊Ajaniakhartensis（LC50/24h＝3.83mg/mL、LC50/48h＝3.75 mg/mL 和 LC50/72h＝3.40 mg/mL）[14]；川甘亚菊Ajaniapotaninii（LC50＝0.27 mg/mL）和灌木亚菊Ajaniafruticulosa（LC50＝0.17 mg/mL）[15]，因此，亚菊属的植物挥发油在开发绿色杀虫剂方面具有较大潜力。

本试验中的丝裂亚菊和光苞亚菊均为我国特有植物，广泛分布于西北地区，作为亚菊属植物，含有大量挥发油，挥发油中多含有萜类、黄酮等成分，具有抗原虫、抗真菌、杀虫等药理作用[16-17]，其中丝裂亚菊挥发油被证实具有抗氧化和抗肿瘤活性[18]。目前关于丝裂亚菊和光苞亚菊挥发油对马铃薯茎线虫的触杀作用尚未报道。本实验室在前期的研究报道中，发现丝裂亚菊Ajanianematoloba挥发油中的主要成分为β-蒎烯（34.72%）、桉叶油醇（24.97%）和马鞭草烯醇（20.39%），光苞亚菊Ajanianitida挥发油中主要成分为樟脑（20.76%）、侧柏酮（18.64%）、桉叶油醇（13.42%）和马鞭草烯醇（5.26%）。同时，以上两种挥发油对防治仓储害虫赤拟古盗Triboliumcastaneum和烟草甲Lasiodermaserricorne具有较好的触杀作用[19]。本研究以丝裂亚菊和光苞亚菊的挥发油及其中共有单体成分为试验材料，测试两种植物挥发油及其主要组分（桉叶油醇和马鞭草烯醇），以及两种主要组分混配溶液分别对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性试验，为植物挥发油绿色防控马铃薯腐烂茎线虫提供基础研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丝裂亚菊的地上部分全叶采集于甘肃省兰州市（35°55′53′′ N，102°54′04′′ E，海拔 2155 m），光苞亚菊的地上部分全叶采集于甘肃省榆中县（35°78′34′′ N，103°93′79′′ E，海拔 2200 m），两种植物由北京师范大学刘全儒教授鉴定；患麻口病的当归（用于收集马铃薯腐烂茎线虫）采集于甘肃省岷县。

正己烷、二甲基亚砜、吐温-20、桉叶油醇、马鞭草烯醇（购自烟台市双双化工有限公司）；克百威（购自上海农药研究所，纯度98.4%）；含灰葡萄孢菌的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基；96孔细胞板。

1.2 挥发油提取

参照实验室前期研究[19]，分别将两种植物的鲜叶风干、阴干、粉碎、称量500 g，放入圆底烧瓶中，加入1500 mL蒸馏水，电热套加热6～8 h后，得挥发油粗品。加正己烷萃取，再用无水硫酸钠干燥处理，即得挥发油。将提取得到的两种挥发油分别密封放置于4 ℃的冰箱保存。

1.3 马铃薯腐烂茎线虫的培养

参考相关文献[14,20,21]，采用贝曼漏斗法从患麻口病的当归中分离线虫400～500条，用0.5%的次氯酸钠消毒。然后离心，弃去上层的消毒液，加入无菌水振摇，再离心，弃去无菌水，重复处理3次，得到无菌的线虫悬浮液约2 mL，接到长满灰葡萄孢菌菌落的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上。于温度25 ℃，湿度80%～90%的培养箱中培养20 d，即得大量马铃薯腐烂茎线虫悬浮液，备用。

1.4 杀线虫活性测定

参考相关文献[22,23]，将丝裂亚菊和光苞亚菊的挥发油及其主要共有成分（桉叶油醇、马鞭草烯醇）分别用5%吐温-20、3%二甲基亚砜（DMSO）和蒸馏水分别稀释成浓度为2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%的溶液。将10 μL马铃薯腐烂茎线虫悬浮液（约含100～150条线虫）及90 μL不同浓度的样品溶液，置于96孔细胞培养板中，混合均匀后置于25 ℃的培养箱中，每组各重复处理5次。等体积的5%吐温-20和3%二甲基亚砜为阴性对照，克百威为阳性对照。在处理24 h和48 h后，分别检查和记录各组线虫死亡与存活情况，用IBMSPSSV.20.0软件计算致死中浓度 LC50。

1.5 桉叶油醇和马鞭草烯醇混配后对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性测定

参考相关文献类似方法[24]，假设经毒力测定A、B两单剂的致死中浓度分别为a和b，利用共毒因子法评价A＋B混剂的毒力指数，将A、B两单剂按一定体积比（1:7，2:6，3:5，4:4，5:3，6:2，7:1）进行混合，即为不同浓度的挥发油测试样品。协同效应的测定采用共毒法联合毒性评价[25]，评价标准以CTC值＞120为增效作用，CTC值＜80为拮抗作用，80≤CTC值≤120为相加作用，其中：实测混用毒力指数（ATI）＝标准药剂LC50/供试药剂（混用）LC50×100；理论混用毒力指数（TTI）＝A的毒力指数×A在混用中的含量（%）＋B的毒力指数×B在混用中的含量（%）；共用系数（CTC）＝实测混用的毒力指数（ATI）/理论混用的毒力指数（TTI）×100。

2 结果与分析

2.1 挥发油对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性

处理24 h后，丝裂亚菊和光苞亚菊挥发油及阳性对照克百威对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性数据如表1所示。结果表明两种亚菊属植物挥发油对马铃薯腐烂茎线虫均具有一定触杀作用，丝裂亚菊和光苞亚菊挥发油对马铃薯腐烂茎线虫的致死中浓度（LC50/24h）分别为1.50 mg/mL和1.23 mg/mL，低于阳性对照组克百威（LC50/24h＝0.01 mg/mL）的杀线活性。

表1 丝裂亚菊和光苞亚菊挥发油对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性（24 h）Table 1 Nematicidal activity of essential oils from A.nematoloba and A.nitida against D.destructor after 24 hours

处理48 h后，丝裂亚菊挥发油、光苞亚菊挥发油及阳性对照克百威对马铃薯腐烂茎线虫触杀活性数据如表2所示。结果表明丝裂亚菊和光苞亚菊的致死中浓度（LC50/48h）分别为1.06 mg/mL和0.70 mg/mL。两种挥发油对线虫的触杀活性虽低于阳性对照克百威（LC50/48h＝0.01 mg/mL），但较处理24 h后的数据相比，两种挥发油的杀线虫活性均有所增强；其中，光苞亚菊挥发油的致死中浓度减小近1倍。

表2 丝裂亚菊和光苞亚菊挥发油对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性（48 h）Table 2 Nematicidal activity of essential oils from A.nematoloba and A.nitida against D.destructor after 48 hours

2.2 桉叶油醇与马鞭草烯醇对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性

桉叶油醇与马鞭草烯醇均为丝裂亚菊和光苞亚菊挥发油中共有的主要成分（含量＞5%），二者对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性数据如表3所示。结果表明，二者对马铃薯腐烂茎线虫均有不同程度的触杀活性，且触杀活性均强于挥发油（挥发油数据见表1和2），说明挥发油中两种主要成分对线虫的触杀作用更强。在两种单体成分中，桉叶油醇的杀线虫活性（LC50＝0.49 mg/mL)强于马鞭草烯醇（LC50＝1.09 mg/mL)，由此推断挥发油杀线虫活性可能与其他主要成分相互影响。在后续试验中，选择活性较强的桉叶油醇和马鞭草烯醇进行不同比例混配测试其触杀线虫活性，深入分析它们之间的协同关系。

表3 桉叶油醇和马鞭草烯醇对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性（含量＞5%）Table 3 Nematicidal activity of eucalyptus and verbenol against D.destructor

2.3 桉叶油醇和马鞭草烯醇混合物对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性

桉叶油醇和马鞭草烯醇混合物对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性及共毒系数（CTC）如表4所示：当桉叶油醇和马鞭草烯醇两种化合物以不同比例配比后，对马铃薯腐烂茎线虫的毒杀活性均增强。七组数据的共毒系数（CTC）均大于120，表现出明显协同作用。其中，桉叶油醇和马鞭草烯醇以2:6、4:4和3:5的体积比混配后，协同效果最明显，其CTC分别达到463.67、397.68和373.53，远大于120；其LC50分别为0.18、0.17和0.20 mg/mL，小于桉叶油醇和马鞭草烯醇单独作用时的LC50（0.49和1.09 mg/mL）。此外，两种化合物的其他配比也表现出协同增效作用，说明这两种化合物能够以较少剂量混配。

表4 桉叶油醇和马鞭草烯醇混合物对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性及共毒系数（CTC）Table 4 Nematicidal activity and CTC of eucalyptol and verbenone mixture against D.destructor

3 讨论

目前国内外关于植物源杀线剂的研究多停留在试验阶段，主要包括寻找并筛选具有杀线虫活性的植物资源，利用植物提取物、挥发油以及其他活性物质杀灭线虫或抑制虫卵孵化，为植物源杀线剂的开发与利用奠定基础[26]。郭霞等[27]测试瑞香狼毒根的乙酸乙酯提取物对马铃薯腐烂茎线虫的毒杀活性较强，24 h处理后校正死亡率为69%，48 h处理可达到80%。张天柱等[28]从山奈根提取物中分离得到两种天然化合物肉桂酸乙酯和甲氧基肉桂酸乙酯，试验发现其对马铃薯腐烂茎线虫具有很强的触杀活性，其LC50分别为43.21和10.09 mg/L。对植物挥发油杀线虫活性的文献主要集中于根结线虫的报道上，关于植物挥发油及其组分抑制马铃薯腐烂茎线虫的文献报道较少。目前只有菊科亚菊属植物铺散亚菊的挥发油被证明对马铃薯腐烂茎线虫具有较强毒杀作用，其作用24 h、48 h后的LC50分别为3.83 mg/mL、3.75 mg/mL[14]。而本试验中丝裂亚菊和光苞亚菊挥发油对马铃薯腐烂茎线虫作用24 h、48 h后的触杀效果均强于铺散亚菊挥发油；且随着作用时间延长，两种植物挥发油对马铃薯腐烂茎线虫的触杀活性增强，二者之间增效机理需在后续相关试验中继续研究。

此外，不同种类的植物源活性物质之间存在相互作用关系，它们可能协同作用于靶标生物，从而放大其生物学效应[29]。将植物挥发油，以及具有杀线活性的植物源化合物按一定比例混合后，对靶标线虫的杀灭活性明显增强。杨秀娟等[30]发现合欢和万寿菊的水提液与淡紫拟青霉混合后，可协同作用于根结线虫；另外，Ntalli等[29]将部分萜类化合物按其半数致死浓度1:1混合，观察混合药剂对南方根结线虫的触杀活性，结果显示，香芹酮＋茴香脑、香叶醇＋茴香脑、香叶醇＋香芹酚等混合药剂对南方根结线虫的触杀作用均显示出协同效应。由于目前亚菊属植物挥发油触杀马铃薯腐烂茎线虫的活性研究相对较少，对挥发油中起到触杀作用的单体物质的混配还未深入研究。而按照植物源混配对根结线虫的高生物活性，亚菊属挥发油中单体成分混配对马铃薯腐烂茎线虫的防治具有一定潜力。

因此，本试验以两种挥发油中的主要共有成分桉叶油醇和马鞭草烯醇为材料，其中桉叶油醇具有抑制病原体合成的药理活性以及天然杀虫的作用[31]，马鞭草烯醇对橡胶小蠹虫具较好粘捕效果[32]，对天山重齿小蠹具明显引诱作用[33]。因桉叶油醇与马鞭草烯醇均属单萜类化合物[34]，该类化合物是植物抵御天敌的良好阻食剂，如昆虫和植食动物侵食过程中，直接产生阻食、毒害作用，以及降低线虫孵化率的作用[35,36]。本次研究发现桉叶油醇和马鞭草烯醇以2:6、4:4和3:5的体积比混配后，协同增效作用明显，其LC50（0.18、0.17和0.20 mg/mL）小于桉叶油醇和马鞭草烯醇单独作用时的LC50。为寻找挥发油中桉叶油醇与马鞭草烯醇的含量接近于以上比例的植物源杀虫剂，提出研究线索。

综上所述，丝裂亚菊和光苞亚菊挥发油及其主要单体成分对马铃薯腐烂茎线虫有一定的毒力作用。挥发油因具有可降解、低毒性、污染小的特性，对于开发绿色环保的杀虫剂，具有一定的研究价值。因此，将丝裂亚菊和光苞亚菊的挥发油及其主要成分开发为新型的植物源杀虫剂，防治马铃薯腐烂茎线虫，具有实际意义。