饲养温度对蠋蝽胰蛋白酶活性的影响及消化器官形态初步观察

朱艳娟，殷焱芳，王 震，陈红印，刘晨曦*

（1.中国农业科学院植物保护研究所/中美生物防治实验室，北京 100193；2.张北县自然资源和规划局，张北 076450）

捕食性蝽使用口外消化作为一种捕食策略，摄食前用细长的针尖状口器刺穿猎物组织，分泌强有力的水解唾液，注入消化酶，同时保持猎物角质层的完整，这种高效的食物摄取和利用系统，对于肉食性昆虫尤为重要[1]。在口外完成初步消化后，吮吸液化的猎物组织到消化道内[2,3]，进一步消化和吸收[4]。消化酶活性直接影响着昆虫对食物消化、吸收的能力，消化酶的相关研究是营养学和饲料学研究的主要内容之一，是了解昆虫消化生理的重要内容。根据消化物质不同，消化酶被分为淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶等。其中，蛋白酶是一种极为重要的消化酶，能将食物中大量的蛋白质进行催化分解为小分子氨基酸被细胞吸收，从而用于昆虫的生长和发育[5]。与植食性昆虫相比，肉食性昆虫分泌更多的蛋白酶[6,7]。胰蛋白酶（trypsin）是肉食昆虫中最重要的一种水解蛋白酶[1,6]，是丝氨酸蛋白酶的一种，以裂解碱性氨基酸羧基侧蛋白链的形式进行水解蛋白，参与了多种生理生化的过程，包括食物蛋白的消化，激素活化和免疫反应[8]，在捕食性蝽的口外消化和肠道消化中起着关键作用，对其生长发育至关重要[9]。

蠋蝽ArmachinensisFallou隶属于半翅目Hemiptera蝽科Pentatomidae，可捕食鞘翅目、鳞翅目等多种农林害虫，捕食范围较广，是一种控害能力很强的天敌昆虫。我国南北地区纬度跨度较大，气温差异显著，蠋蝽在我国东北、华北、华中、华东和西南等地区均有分布[10]，环境适应性强。目前主要围绕蠋蝽的生物学特性[11-18]、室内扩繁[19-25]及捕食范围[26-27]等方面做了大量研究，而蠋蝽消化酶活性的研究尚缺少报道。有研究表示，昆虫的消化道是昆虫体内与外界环境接触的最主要的区域，蝽的消化酶起源于唾液腺复合体而不是中肠[28]。鉴于此，本试验围绕蠋蝽的唾液腺和中肠两个消化部位的胰蛋白酶活性进行研究。根据我国南北方气温差异特点，设置了5个温度梯度，测定不同温度下蠋蝽唾液腺和中肠的胰蛋白酶活性，分析蠋蝽对饲养温度的生理生化适应性，探寻蠋蝽主要消化酶的适宜温度，以期为蠋蝽的最适饲养温度及不同地区田间释放的最佳季节提供生理生化方面的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

蠋蝽饲养在人工气候箱内，环境条件设置为温度（26±1）℃，相对湿度（65±5）%，光周期16L:8D。用柞蚕蛹饲喂。柞蚕蛹购于辽宁省西丰县农丰生防专业合作社。

1.2 温度对蠋蝽胰蛋白酶活性影响

1.2.1 试验设计 将试验处理温度设置为15 ℃、20 ℃、26 ℃、30 ℃和35 ℃五个梯度。选取人工饲养的蠋蝽种群蜕皮后1 d的成虫接入直径55 mm的硬质塑料培养皿容器中，进行单头饥饿处理，为防止蠋蝽逃逸，培养皿上加盖，盖上打满小孔，孔径2 mm，增加容器内透气性。培养皿内放置浸湿蒸馏水的脱脂棉块为蠋蝽提供水源，在温度（26±1）℃、光周期 16L:8D、相对湿度 65%±5%的饲养环境内，经饥饿处理24 h后，把蠋蝽放入300 mL硬塑料太空杯中，纱网封盖杯口，用细橡皮筋固定，防止逃脱；在纱网上放置鲜活柞蚕蛹和一块2 cm×2 cm方形脱脂棉浸足水分，为蠋蝽提供生长充足的食物和水分。然后，分别放入预先设置好的5个温度的培养箱内，每个温度处理设置3组重复，每组20头。饲喂24 h。

1.2.2 组织样品准备 将不同温度处理后的蠋蝽，先用蒸馏水冲洗干净，然后用滤纸吸取表面水分，再用75%酒精消毒后放置于盛有预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2～7.4）的解剖盘中，剪去双翅及足部，在解剖显微镜下，用精细镊子划开蠋蝽前胸腹板，用镊子夹住身体固定，另一个镊子夹住头部轻拉，显露出完整的唾液腺复合体及中肠，剥除肠道外壁粘连的脂肪体，在PBS拓展液中冲洗干净，迅速分别放入预冷的1.5 mL的离心管中。每个温度处理的样品包括唾液腺和中肠两个部位，设3个生物学重复，3个技术重复，每个生物学重复收集20头蠋蝽的组织。用液氮速冻，放入-80 ℃冰箱内保存备用。

1.2.3 酶液制备 将已备的组织样本，分别液氮中研磨，称取1 g，再将9 mL的PBS缓冲液（pH 7.2～7.4）加入1.5 mL的离心管中，用电动研磨棒在冰上研磨充分成匀浆，离心20 min（2000～3000 r/min），吸取上清液作酶液，分装待测。-80 ℃冰冻保存。测试前4 ℃下解冻。

1.2.4 胰蛋白酶活性测定 使用昆虫胰蛋白酶 Trypsin酶联免疫分析试剂盒，利用双抗体夹心法，用纯化的昆虫胰蛋白酶抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入待测样品，再与 HRP标记的胰蛋白酶抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下终止反应，形成最终的黄色，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中昆虫胰蛋白酶活性浓度。设置3个生物学重复，3个技术重复。

1.2.5 蠋蝽消化器官的初步观察 从蠋蝽种群中选取新羽化24 h健康体壮的成虫，用蒸馏水冲洗干净，后用滤纸吸取表面水分，放入预冷PBS缓冲液中，减缓虫体行动，在立体显微镜下，将蠋蝽的口器、唾液腺及中肠完整解剖取出（解剖步骤见1.2.2），使用超景深三维显微系统（vhx-2000）观察及拍照口器全貌，用立体显微镜取出蠋蝽唾液腺观察及拍照。

1.3 数据统计与分析

采用统计分析软件Graphpad 7.0进行方差分析，不同处理间的显著差异性用LSD进行检验。文中数据以平均值±标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 温度对胰蛋白酶活性的影响

2.1.1 温度对蠋蝽唾液腺胰蛋白酶活性的影响 通过方差分析得出，不同温度下蠋蝽唾液腺胰蛋白酶活性存在显著差异（F4,10＝35.33，P＜0.0001），26 ℃温度饲养下的胰蛋白酶活性浓度最高，平均为1413.9 IU/L，其次浓度较高的是20 ℃，平均为863.6 IU/L，30 ℃和35 ℃温度下的胰蛋白酶浓度略低于20 ℃，但无显著差异，15 ℃时胰蛋白酶浓度最低，平均为289 IU/L（图1）。

图1 不同温度下蠋蝽唾液腺的胰蛋白酶活性浓度Fig.1 Trypsin activity concentration in salivary glands of A.chinensis at different temperatures

2.1.2 温度对蠋蝽中肠胰蛋白酶活性的影响 不同温度下蠋蝽中肠胰蛋白酶活性存在显著差异（F4,10＝52.55，P＜0.0001），26 ℃饲养下的胰蛋白酶活性浓度最高，平均为1029.2 IU/L，其次为20 ℃，胰蛋白酶平均浓度为711.8 IU/L，30 ℃时胰蛋白酶浓度略低于20 ℃时，但无显著差异，35 ℃时显著下降，15 ℃饲养下的胰蛋白酶浓度最低，平均为231.3 IU/L（图2）。

图2 不同温度下蠋蝽中肠的胰蛋白酶活性浓度Fig.2 Trypsin activity concentration in midgut of A.chinensis at different temperatures

2.1.3 不同温度下蠋蝽唾液腺与中肠间胰蛋白酶活性的比较 在不同饲养温度下，蠋蝽唾液腺胰蛋白酶活性均高于中肠胰蛋白酶活性，其中26 ℃温度下，唾液腺显著高于中肠，但在15 ℃、20 ℃、30 ℃和35 ℃温度条件下，两个部位的胰蛋白酶浓度无显著差异（图3）。

图3 不同温度下蠋蝽唾液腺和中肠的胰蛋白酶活性浓度Fig.3 Trypsin activity concentration in salivary glands and midgut of A.chinensis at different temperatures

2.2 蠋蝽口器与唾液腺形态初步观察

蠋蝽的口器：刺吸式，由上唇（labrum）、喙（proboscis）和口针束（stylet fascicle）三部分组成。不取食时，喙通常紧贴着前胸腹板正中，长度至第三对足基节中间。上唇较短，与喙的近端口重合，被半包于喙基部第一节；喙呈细长圆柱体状，由4个关节组成，近端和远端都有开口，里面包被着口针束；口针束细长如丝，共4根，与喙长度相近。取食时，喙从胸足间抽出，远端口伸出口针束，第一节与第二节折叠呈一定角度，与上唇和口针束重合处形成三角区（图4）。

图4 蠋蝽口器观察图Fig.4 Photos of the mouthpart of A.chinensis

蠋蝽的唾液腺：主要包括一对主唾液腺和主唾腺管、一对副唾液腺和副唾液腺管，主腺分前叶和后叶，内容物在立体显微镜下观察整体呈透明状（图5A）。

蠋蝽的消化道：从食道开始，与之相连的是嗉囊（crop），形状膨大，下端连接中肠（midgut），中肠呈管状，粗壮发达，可分为三部分，即中肠第一节、第二节、第三节，多为浅黄色内容物（与取食猎物有关），与中肠第三节相连的是后肠（hindgut），较为短小，不好区分回肠、结肠、直肠，末端开口于肛门（图5B）。

图5 蠋蝽消化系统结构图Fig.5 Structure of digestive system of A.chinensis

3 讨论

本研究结果表明，饲养温度的变化显著影响着蠋蝽的生理代谢过程，不同温度下蠋蝽体内胰蛋白酶活性均不一样，且唾液腺的酶活性均高于中肠的酶活性，26 ℃既是酶活性呈现最高值的温度，又是两个部位差异表现最显著的温度。在15～26 ℃，随着温度的升高蠋蝽唾液腺和中肠内胰蛋白酶活性均呈现上升趋势；26～35 ℃，随着温度的升高，胰蛋白酶活性呈现下降趋势。在五个温度梯度范围内，胰蛋白酶活性表现出先上升后下降趋势，这与金银花尺蠖Heterolochaaphaga[29]、黄粉虫Tenebriomolitor[30]等昆虫，以及刺参Apostichopusjaponicus[31]、波纹龙虾PanulirusHomarus[32]等变温动物一样，均呈现先上升后下降的变化趋势。这可能是酶参与昆虫的新陈代谢，在一定温度范围内，酶在低温时活化分子较少，催化分解作用速率低，随着温度上升，酶的活化分子逐渐增多，加速了催化反应，催化活性随之增强，超过生长发育的适温区，高温下酶蛋白发生变性，其催化活性随之下降，昆虫体内代谢失去平衡，生化机能受到明显抑制。这一温度范围，与蠋蝽在我国分布区域的气候条件相吻合，春夏季农林作物生长速率快，尤其在夏季雨季，作物和害虫快速生长，而蠋蝽主要的消化酶活性恰好在 20～26 ℃呈现上升，食物需求量大，在此时期进行蠋蝽的田间释放，食物的大量需求，促使其捕食更多猎物，可有力遏制害虫数量，防止虫害大规模发生，极大地提高了生物防治效率。

适宜环境温度下，蠋蝽唾液腺及中肠内均具有较强的蛋白酶活性，尤其唾液腺复合体内的胰蛋白酶活性显著高于中肠，表明它的胰蛋白酶主要来自唾液内，通过口外消化初步利用食物中的蛋白来源。Cohen[1]曾研究得出，胰蛋白酶从唾液腺通过唾液管分泌到食物中，再与食物一起摄入，并在肠道中使用，以继续分解蛋白质[1]。Oliveira[33]在黑刺益蝽Podisusnigrispinus唾液腺中检测到重要的消化性蛋白酶。由此可见，捕食性半翅目昆虫具有口外消化特点，其唾液腺体中，常有胰蛋白酶，并被认为是捕食性昆虫主要的唾液蛋白酶[1,4,34]。本试验测定了蠋蝽体内基本的消化酶活性，为蠋蝽消化系统的后续研究奠定了基础，同时为蠋蝽的人工饲料酶类添加剂的研制提供了理论依据。

昆虫消化系统由唾液腺和消化道组成，昆虫消化道主要由三部分组成：前肠、中肠及后肠，前肠又分为咽喉、食道、嗉囊和前胃四个部分[35]；中肠具有胃盲囊和胃；后肠包括回肠、结肠和直肠[36]。研究发现，蠋蝽消化系统与其他半翅目昆虫一样，较为复杂，唾液腺是由不同的叶状体及附管组成的复合体，主要包括一对主唾液腺和一对细管状副唾液腺[34-38]，这些腺体的内容物是透明和含水的，这为它们作为水回收器官的作用提供了支持[1,39,40]，副腺体可能参与消化过程的水循环，保障大量的唾液流动，稀释并初步分解被摄取的猎物，促进营养吸收[1]。蠋蝽消化道大体分为食道、嗉囊、中肠和后肠，食道是一条管道，后端膨大形成的嗉囊是储存场所，暂存着经过口外初步消化的食物及唾液腺分泌的唾液；中肠是消化食物和吸收营养物质的主要区域[36,41,42]，多呈管状，是分泌消化酶和吸收营养物质的重要场所。经解剖观察发现，蠋蝽的中肠较长，呈管状，粗壮发达，说明蠋蝽中肠消化能力较强。蠋蝽中肠可分为三个部分，这与半翅目昆虫的中肠常划分为 3～4段[43]相一致。第一部分消化功能最强，其内消化酶浓度最高；中肠第二节含有一定的消化酶，会对食糜物再次消化吸收；中肠第三节多呈膨大状，内容物多为食物残渣，其内消化酶大量减少。鉴于此，在对半翅目蝽科昆虫的消化生理研究时，可选择中肠的第一、第二节作为重点研究部位，研究相关排泄系统时，可增加中肠第三节部分。

蠋蝽口器作为昆虫摄食源头的功能器官，对其研究是理解其生态的重要途径。Coronado等[44]也认为，昆虫口器的结构影响其取食模式及被消化的食物类型。半翅目昆虫是典型的刺吸式口器，特化为针状结构，有利于口器在猎物体内组织间穿刺，从而特异性地吸食猎物营养丰富的体液[45]。观察发现，蠋蝽口器的喙由4个关节组成，这与其他蝽科昆虫的喙有3节组成不同[37]。蠋蝽的口针束同时刺入猎物体内后，口针在猎物体内可分散穿向不同方位进行吸取营养物质，能很好地反映捕食性蝽的取食机制[46-49]，研究中发现蠋蝽更喜取食固态物质，可能因为流质食物稀释了捕食者的口外分泌物，且很难恢复它们注入人工猎物体内的消化酶[41]，阻碍正常消化。本文通过对蠋蝽的口器进行初步的显微镜观察，探讨口器结构与功能的关系，为探索蠋蝽口器的取食控害过程，为天敌昆虫的人工饲料固液形态的研发提供参考。